图1. 50μg/ml 2种孔雀石绿及其氘代物色谱图。

本文建立了SPE-LCMS/MS测定粕类等植物源饲料中孔雀石绿的检测方法。用乙腈结合基质分散固相萃取，提取液经蒸干浓缩后用中性氧化铝和阳离子交换固相萃取柱净化, 使用HPLC-MS/MS进行检测，方法满足粕类等植物源饲料中孔雀石绿的检测需求。

孔雀石绿是一种三苯甲烷类染料，被广泛用于预防与治疗各类水产动物的水霉病、鳃霉病和小瓜虫病等。孔雀石绿具有高残留和致癌、致畸、致突变等副作用，鉴于其危害性，加拿大于1992年就禁止将其作为渔场杀菌剂，加拿大和美国均规定在食用水产品中禁止检出孔雀石绿和无色孔雀石绿。欧盟于2002年6月也颁布法令禁止在渔场中使用孔雀石绿。我国于2002年5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》，并在2004年后出台了一些针对水产品中孔雀石绿的检测方法。2009年我国农业部也颁布了饲料中有关孔雀石绿及其代谢物的检测标准，饲料作为动物的食物来源也被纳入了孔雀石绿检测项目之中，主要针对的饲料品种为于配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料、鱼粉等。2011年在对一些进口豆粕、菜籽粕类产品质量安全情况进行监督检测时，多次发现从印度进口的粕类产品含有孔雀石绿和无色孔雀石绿。粕类是动物饲料生产的重要原料，是保证动物健康和动物安全卫生的关键，粕类产品中检出孔雀石绿的现象应当引起高度重视。据了解，粕类中加入孔雀石绿具有防霉、防虫的作用，因此不排除人为蓄意添加的可能。因此本文的工作目的是为了更新国家标准方法，建立粕类饲料中孔雀石绿检测的方法。

图2. MG子离子扫描图。

仪器与试剂

高效液相色谱串联质谱仪：配电喷雾（ESI）离子源。安捷伦Vac Elut SPS 24 固相萃取装置，安捷伦Bond Elut AL-N 500mg，3ml和Bond Elut PRS 500mg，3ml强阳离子交换固相萃取小柱。

图3. LMG子离子扫描图。

Bond ElutBondesil AL-N散装中性氧化铝，孔雀石绿草酸盐标准品：纯度≥95％。乙腈和甲酸为色谱纯，甲酸为优级纯，其余试剂均为分析纯， 实验室用一级水由Millipore milli-Q超系统制备。

图4. 内标D6-LMG子离子扫描图。

实验方法

仪器条件

液相色谱条件 参考原饲料中孔雀石绿检测标准《NY/T 1756-2009》提供的色谱条件：色谱柱为C18柱（150 mm×2.1mm，3.5μm）；流动相为0.1％甲酸溶液+乙腈=22+78（v+v）；流速0.25ml/min；柱温50℃；进样量20μl。

图5. 内标D5-MG子离子扫描图。

质谱条件 离子源：电喷雾ESI 离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；雾化气、锥孔气均为高纯氮气；碰撞气为高纯氦气。使用前调节各气体流量，以使质谱灵敏度达到检测要求，喷雾电压、碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度，质谱条件见表1。

图6. 孔雀石绿和无色孔雀石绿的线性关系图。

标溶液的配置

标准储备溶液 准确称取孔雀石绿革酸盐、无色孔雀石绿、氘代孔雀石绿、氘代无色孔雀石绿标准品，用乙腈分别配制成100μg/ml 的标准贮备液，-18℃避光保存备用，有效期为3个月。

表1. MG和LMG优化后的质谱条件

混合标准储备溶液 分别吸取孔雀石绿和无色孔雀石绿的标准储备溶液用乙腈稀释成1μg/ml，-18℃避光保存，有效期为1个月。

混合内标储备溶液 分别吸取氘代孔雀石绿和氘代无公孔雀石绿标准储备溶液用乙腈稀释成1μg/ml，-18℃避光保存，有效期为1个月。

混合内标工作溶液 用乙腈稀释内标储备溶液，配制成每毫升含氘代孔雀石绿和氘代无色孔雀石绿各100ng的混合内标工作溶液，-18℃避光保存，有效期为1个月。

混合标准工作溶液 根据需要，临用时用流动相稀释混合标准储备溶液，和混合内标储备溶液，配制成适当浓度的混合标准工作溶液，根据所检测的样品进行添加，保证样液中的内标物质的量与标准品中内标物质浓度一致。

表2. 孔雀石绿定量限实验结果

样品前处理

提取 称取粕类取饲料样品约5g（ 精确到0.001g），置于50ml离心管中，依次加入200μl混合内标工作液、约5g散装中性氧化铝、20ml乙腈，涡旋混匀，超声30min；于8000r/min离心10min，倾出上清液至旋转蒸发瓶中，另取20 ml乙腈重复提取1次，合并上清液；在35℃下减压蒸至近干，用5ml乙腈溶解残渣，待净化。

净化 将Bond ElutAL-N 柱串接Bond Elut PRS柱上方，用5ml乙腈活化。将5ml提取的乙腈溶解液过柱，另取5ml乙腈清洗旋转蒸发瓶，溶液过柱，重复以上操作1次，取5ml乙腈淋洗柱子。移去中性氧化铝柱，用5ml 1.0％甲酸水溶液：乙腈（1:5）淋洗Bond Elut PRS阳离子交换柱，弃去流出液，抽干；用5ml洗脱液5%氨水甲醇5ml洗脱。收集洗脱液，用氮气在50℃吹至近干，用流动相溶解残渣，并定容到适当的体积，6000r/min 高速离心后去上清液经0.22μm滤膜过滤后上机测定。

表3. 无色孔雀石绿定量限实验结果

结果与讨论

色谱质谱条件的优化

直接参考原饲料中孔雀石绿检测标准《NY/T 1756-2009》提供的色谱条件，根据孔雀石绿（MG）和无色孔雀石绿（LMG）的性质和结构，选择ESI（+）作为电离模式，分别对电离电压、离子源温度、碰撞能量等条件进行优化，通过全扫描方式观察总离子以MG为基准（浓度2.0μg/ml），采用每次进样10μl的流动注射的方式在正离子模式下对4种物质进行母离子全扫描，确定MG、LMG和内标MG-D5、LMG-D6的m+1离子分别为m/z 329、m/z 331、m/z 334和m/z 337。然后分别以所得的m/z数为母离子，MRM分析谱图见图1，对其子离子扫描见图2~5。

表4. 玉米空白样品中孔雀石绿及无色孔雀石绿的加标回收测定结果

样品前处理过程

根据孔雀石绿和无色孔雀石绿的弱阳离子特性，以及粕类饲料基质中含有的蛋白和油类干扰较多的特性，在提取中加入中性氧化铝吸附剂以吸附杂质，同时选择中性氧化铝结合强阳离子交换吸附剂，不但可以有效去除油脂类干扰物，还可以选择性萃取两种孔雀石绿组分。由于在试验过程中发现脂肪含量比较高的样品，在洗脱后吹干定溶时会发生分层显现，因此在过滤膜前增加离心过程，可以有效解决溶解后的分层现象。

表5. 豆粕空白样品中孔雀石绿及无色孔雀石绿的加标回收测定结果

线性范围和检测限

根据标准《NY/T 1756-2009》提供的色谱条件，在标准提及的色谱条件下，观察孔雀石绿和无色孔雀石绿标准溶液浓度与响应间的线性相关。

采用内标法对定量离子对进行定量计算，以MG-D5（m/z334/318）计算MG（m/z 329/313）的浓度，以LMG-D6 （m/z 337/240）计算LMG（m/z 331/315）的浓度。分取适量的孔雀石绿和无色孔雀石绿标准品工作液，加入50ng/ml的D5-孔雀石绿和D6-无色孔雀石绿100μl，再用流动相稀释至1.0，5.0，10.0，50.0，100.0ng/ml的系列标准溶液。以待测物浓度为横坐标，以待测物峰面积为纵坐标，建立线性关系（见图6）。从图5中可以看出，在1.0~100ng/ml浓度范围内，孔雀石绿、无色孔雀石绿标准溶液与峰面积间存在良好的线性，也表明了色谱条件、质谱条件的稳定性。

表6. 棉籽饼空白样品中孔雀石绿及无色孔雀石绿的加标回收测定结果

《NY/T 1756-2009》标准中液质的方法规定孔雀石绿、无色孔雀石绿定量限均为1ppb。研究分别对玉米、豆粕、棉籽粕、DDGS 4种粕类基质较复杂的原料进行了空白添加试验。添加的浓度为1.0μg/kg，孔雀石绿和无色孔雀石绿的回收率均在90%以上，相对标准偏差均≤20%，完全符合原标准方法规定孔雀石绿和无色孔雀石绿的定量限。见表2~3。

表7. DDGS空白样品中孔雀石绿及无色孔雀石绿的加标回收测定结果

准确度和精密度

以玉米、豆粕、棉籽饼、菜籽饼、DDGS的空白样品为实验材料，向空白样品中添加标准品，添加浓度水平为1.0μg/kg 、5.0μg/kg、10.0μg/kg然后按照上述方法进行提取、净化、测定，以内标法计算来验证方法的回收率。方法的回收率和精密度列于表4~7。

小结

本方法对于植物性粕类等基质比较复杂的原料能够获得良好的测定结果，孔雀石绿和无色孔雀石绿的回收率均在75%以上，相对标准偏差均≤20%，满足原检测标准技术要求。本方法在1~10μg/kg添加浓度范围内，平均回收率为74.2%~100%，RSD小于20%。方法满足粕类植物性饲料中孔雀石绿的测定需要。