图1. SIM的HT-HPLC-200柱温炉可使温度作为液相色谱的活性参数。

在近年来所开发的一系列液相色谱方法中，温度梯度淋洗方法有着独特的应用，尤其是在要求以纯水为流动相的色谱分析中。本文介绍了如何将已存在保留时间的模型发展成为温度梯度淋洗的HPLC方法。

在高效液相色谱（HPLC）的方法开发中，原则上都是采用反复试验法来建立的，实验室用户根据自己的经验来改变一些参数以解决其色谱分离的问题，但是这一过程耗费大量时间和财力。HPLC梯度淋洗的原理已于1980年为Synder所提出，为此方法的开发利用了商业化的软件程序例如Drylab 程序系统。借助这种软件，可以将溶质的保留行为对各种色谱参数的依赖关系建立模型，通常是对梯度作用时间tG、温度T，或者溶剂强度B的百分含量以及流动相的pH值同时进行优化。由能源和环境研究所与应用色谱Mornal研究所共同合作的项目，旨在将Synder提出的模型作进一步的发展。近年来，温度参数在液相色谱中正显得越来越重要，尤其是一系列要求用纯水作为流动相的分析中。

HPLC中的温度梯度

为了将温度作为高效液相色谱中的参数加以利用，必须满足不同的前提。首先是需要一种高温柱温炉来控制流动相和固定相的温度，这种装置应该在流动相进入分离柱之前加以预热。另一前提是，将流动相离开分离柱之后降低到确定的温度。如此构想的加热系统已通过与德国能源与环境研究所IUTA的合作开发成功，现在通过SIM公司以HT-HPLC-200柱温炉的模型名称销售（见图1）。这种模块化构建的系统由淋洗液预热部分、柱加热部分和淋洗液冷却部分组成，每一模块均可单独控制和编程，该加热系统的工作范围是30~200℃。此外，柱温炉还能够以30℃/min的速率加热或冷却，所以可于很短时间内冷却到起始温度。

图2. 依附于柱内径的模拟和实验测得的保留时间的比较。

另一前提，就是保证在高温HPLC的例行加热时固定相的温度稳定性。当前仅有很少的商品分离柱具有这种足够的温度稳定性。除了多年来商业上提供的基于二氧化钛和二氧化锆这类金属氧化物的分离柱之外，还有基于二氧化硅的合成材料可以应用，并在超过100℃的高温下具有良好的温度稳定性。其中Waters-BEH材料的温度和pH稳定性尤为出众。

目前的问题是，在液相色谱中，为什么必须应用温度梯度？本文开头已指出，一系列的联合技术是基于应用纯水作为流动相。为了使样品中所含的物质都能够被淋洗出来，在色谱进行的过程中淋洗液的强度必须予以提高。因为这里没有其他溶剂梯度淋洗可用，惟一的可能性就是温度梯度淋洗了。可是迄今为止还没有任何一种软件，能够针对液相色谱中溶质与温度的依赖关系建立模型。不过Synder工作小组已经指出，线性溶剂强度模型（LSS）能够适合并成功地用于气相色谱(GC)中编程的温度梯度之中。这种用线性淋洗-强度模型（LES）来表示的模型现在就要应用到液相色谱的温度梯度中。

图3. 开发用纯水分离磺胺类物质的方法时对Drylab软件的抓图。

结果与讨论

与HPLC不同，在气相色谱中仅仅采用温度梯度模型。值得注意的是，在GC中应用温度时，由于所用分离柱仅具有微小内径，所以温度的影响是直接的。在LC中则可以想到，由于分离柱的内径在2.1~4.6mm之间，温度对于置于柱温炉中的柱子的影响会有一定的滞后。究其原因，是由于形成了径向的温度梯度。如果采用的加热系统，其编程的温度并不相应于分离柱的实际温度，正如常用的空气炉不带溶剂预热的情况那样，则需要考虑到溶质的保留时间模型中依附于温度的时间滞后问题。为查明这种滞后，直接测量柱床中的实际温度也许很有意义，可是要在一种高压系统中和温度高达200℃的情况下要做到这点，从实验的角度来看是难于实现的。在必须考虑这种与温度有关的时间滞后作用时，也可以通过对温度梯度的模拟来进行评估。为此应用了由6种类固醇所组成的混合物，采用纯水流动相的温度梯度的测定，在两支具有不同内径的Zirchrom PRD-分离柱上进行（Zirchrom PRD，150mm×3mm，5μm；Zirchrom PRD，100mm×1mm；3μm），这种柱材料由二氧化锆加聚丁二烯镀层而成。用于基线测量时选用的温度范围是60~160℃，温度梯度提升率采用1.5、3.0、4.0和6.0℃/min，然后温度梯度提升率采用1.5和4.0℃/min，以便对带有温度梯度提升率3.0℃/min的色谱图进行模拟，最后将这种模拟结果与利用不同内径的两种PRD-分离柱通过实验测到的保留时间进行比较（见图2）。可以看出，介于Drylab模型与实验结果的最大偏差值对于3mm内径柱为13s，对于1mm内径柱为23s，相对于总分析时间25min来说，这种偏差是很小的。在观察相对误差时亦是如此。在应用3 mm 内径柱时，模拟的保留时间相对误差为0.2%~1.3%，而应用1mm内径柱时，模拟相对误差为0.6% ~1.5%。这种偏差是如此之小，以致在模拟温度梯度和利用SIM-HT-HPLC-200高温炉时不必考虑温度引起的时间滞后问题。

图4. 利用温度梯度淋洗分离5种磺胺物质和尿嘧啶。

磺胺类药物的分离

此处所描述的模拟模型的效率可以通过应用纯水分离5种磺胺药物的例子表现出来。首先在60~180℃的温度范围以2~6.0℃/min的梯度提升率测出两条基线。然后将其保留数据置入Drylab软件中来进行方法开发。图3是“梯度编辑器”在优化磺胺药物分离时的抓屏图。图的上部窗口显示带有相应梯度点的编程的温度梯度。用户在进行方法开发时，可以根据相应规定，例如所要求的最低分离度对温度梯度加以改动，图的下部窗口显示所分离的相应色谱图。将上下对照就可以直观地看出，温度梯度曲线上的哪些改变可以影响溶质的分离。 图4显示在60~180℃、分析时间为12min时优化的纯水-磺胺分离色谱图（固定相：Waters Xbridge BEH C18，75mm×4.6mm，2.5μm；流动相：含0.1%甲酸的100%去离子水；流速：1.0 ml/min；注射体积：1μl；检测：UV 270nm；温度梯度见图4）。各种物质均为基线分离，介于磺胺嘧啶和磺胺噻唑之间的临界分辨率达到3.4。为了显示精密度，于表1中列出了由模拟和由实验测得的保留时间的比较。介于模拟和实验之间的偏差很小，其最大相对误差仅为1.5%。除了精准地预测保留时间之外，还可以对预设的分离度进行模拟，这可应用前述模型来给定。相邻两峰（磺胺嘧啶和磺胺噻唑）之间的临界分辨率以3.2%的相对误差被精准地预测出来。

表1. 优化磺胺物质分离时采用模拟和根据实验测得的保留时间的比较

总结与展望

本研究表明，在液相色谱中应用温度梯度淋洗可以对保留时间和临界分辨率进行准确预测。基于这样的结果，Drylab 2010-HT已在这种温度梯度模型方面加以扩展。此外还表明，在应用SIM-HT-HPLC-200 柱温炉于温度梯度的模型计算时，不必考虑基于温度的保留时间滞后的问题。因此，装置加热系统就能非常理想地适于液相色谱中的温度梯度淋洗。

本研究计划得到了联邦经济与技术部（BMWi）经由德国工业研究联合会（AiF）项目编号为KF 0087408 DA7的财政资助。

背景知识：高温HPLC

采用纯水淋洗剂的反相色谱

基于用纯水作淋洗剂的反相HPLC分离已由Morlar和Horvath于1976年所报道。这一在当时被称为“纯水反相色谱（NARP）”的分离技术，利用的是水在不断增高的温度下越来越趋于非极性这样一种效应。由此可以对一些像类固醇这样具有很强的非极性的物质进行分离，而不用附加任何改进剂到反相（RP）中进行分离。今天这一技术主要以高温HPLC的概念而著称，此时温度所延伸的范围大约是60~200℃。