【UNIFI^®整体解决方案应用于中药质量控制】

本实验采用UNIFI^®天然产物整体解决方案中二元比较的工作流程，对两个厂家的双黄连口服液化学组分的异同进行快速准确的检定，以便了解不同厂家产品的成分差异，有助于厂家监控不同批次间产品的质量稳定性。也为所有类似情况的不同样品的二元比较工作提供了简单、有效的解决方案。

沃特世UNIFI^®天然产物整体解决方案以超高效液相色谱(ACQUITY UPLC I-Class)，四级杆飞行时间质谱(Xevo G2-S Q-TOF)以及UNIFI中药数据库为基础，采用UNIFI二元比较工作流程对类似的样品进行比较，高分辨率UPLC/Q-TOF联用技术有缩短样品分析时间、提高分离效率、专属性高、检测限低、进样量小、溶剂消耗少、自动化程度高、定性能力高等特点。被越来越多的应用于中药质量标准控制。

实验条件

样品处理

取双黄连口服液200 μl溶解于2 mL H₂O中(相当于稀释十倍)，备用。进样体积为1 μl。

液相色谱条件

仪器：ACQUITY UPLC I-Class带FTN 样品管理器

色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3，2.1×100 mm 1.8 μm，40 ℃;样品室温度：15 ℃

流动相A：水 (0.1% 甲酸);流动相B：乙腈

梯度：

质谱条件

仪器： Xevo G2-S Q-TOF;采集范围：100-1500 Da;扫描时间：0.1s;采集模式：ESI+和ESI-分辨率模式，MSE ;Lock mass：亮氨酸脑啡肽(LE)1 ppm;(0.3s扫描，间隔15s);毛细管电压：3 KV(ESI+)/ 2.5 KV(ESI-);锥孔电压：100 V;碰撞能量(eV)：低CE：6 / 高CE：20-45;电离源温度：120 ℃;脱溶剂温度：500 ℃;锥孔气流速：60 l/h;脱溶剂气流速：1000 l/h;数据采集时间：15 min;

应用方案讨论

中国有很多厂家都生产该口服液产品。故我们借此极有代表性的实例来阐述UNIFI天然产物整体解决方案二元比较工作流程(见图1)。UNIFI天然产物整体解决方案包括ACQUITY UPLC I-Class、Xevo G2-S Q-TOF以及含中药数据库的UNIFI软件平台。该解决方案中包含了五个预设的二元比较工作流程模板及一个结果报告模版，使数据的采集与处理、数据库检索、结构确认以及打印报告全部自动化。

图2. 双黄连口服液的UPLC/QTof MS基峰BPI离子色谱二元比较图(2a：厂家一的产品;2b：厂家二的产品)。

图2是不同厂家双黄连口服液的UPLC/QTof MS基峰离子色谱对比图(BPI)。此图显示了采用UPLC分析复杂中药体系的优势，运行时间短(有效分离时间12 min)，且分离效率与峰容量皆高。同时，四级杆飞行时间质谱又提供了含精确质量信息的质谱数据。除此之外，从图2中可初步看出这两个厂家的口服液成分复杂但大多类似，不借助软件而从两个样品中快速准确找出其异同点几乎是不可能的。

天然产物研究无论是单一样品组分定性还是不同样品的组分比较, 明确组分的详细信息是进一步研究的基础。从UNIFI中药数据库中导入与金银花、黄芩、连翘中药材有关的所有化学成分，然后进行数据处理，并对样品中的组分信息进行鉴定。点击任何一个预设的二元比较模板，便可得到与之相关的结果信息。

图3. UNIFI软件处理不同厂家双黄连口服液的二元比较结果。

图3a显示了UNIFI中预设的十四个工作流程模板。图3b是两个厂家样品的UPLC/Q-TOF组分二元比较图。该图中的绿色棒状图为与中药数据库所列成分所匹配且软件自动鉴定的成分，黑色棒状图为没有找到匹配因而无法自动鉴定的成分。图3c是与图3b相对应的单一选择离子色谱图(XIC)比较(该图显示了保留时间4.03min的连翘酯苷B的XIC的比较)。图3d则是对应于3c所示成分的低能量通道质谱图比较。

若想进一步了解两个样品间的异同，可分别通过点击预设的Binary-Common(B-C)工作模板或Binary-Difference(B-D)工作模板直接看到两个样品间的相同成分与不同成分。

图4. 点击Binary-Common工作模板所得的结果

图4a列出了两个样品中的相同组分(初步结果是1978个)。图4b显示了相应于图4a的每个组分在两个样品中的质谱响应值，反应了该成分在每个样品中的相对含量(该图显示的是汉黄芩素)。若点击(B-D)工作模板，便可得到类似界面，结果显示则是两个样品中的成分差异(初步结果是408个)。

图5. 两个口服液产品经二元比较以后所得成分差异图。

通过使用(B-C)工作模板与(B-D)工作模板得到的两个样品间成分异同可用棒状图直观显示。比如，在点击(B-D)工作模板后得到两个样品中成分差异的结果，可通过点击组分概要列表中的组分图直接看到图谱(图5)。可清晰直观的观察到两个样品间的差异。结果显示，厂家一的样品黄芩苷含量明显高于厂家二，而连翘中很多组分例如连翘酯苷A、连翘酯苷B、右旋羟基连翘酯苷A等成分在厂家二的含量远高于厂家一。图5中还显示样品中某些组分在数据库中无数据匹配，故无鉴定结果。

两个样品的成分差异的详细信息可进一步通过应用Binary-Reference Unique及Binary-unknown Unique这两个工作模板了解，从而可以得到每个样品中的特有组分列表。UNIFI二元比较需要将其中一个样品列为参照样品(色谱或质谱峰在上)，而将另一个样品列为未知样品(色谱或质谱峰在下)。在我们的样品中，我们随意将厂家二的样品定为参照样品，厂家一的样品定为未知样品。若想进一步观察厂家一样品中特有的成分直接点击BUU模板即可，见图6。

图6. 点击Binary- Unknown Unique模板所获得的厂家一的样品中特有的成分。

图7. 通过导入天然产物组分信息总揽二元比较报告模自动得到的报告。

在对结果确证满意之后，可直接利用预设的二元比较报告模板打印报告。该报告包括了样品的信息，样品的采集和后处理方法，以及相同组分和不同组分信息的详细列表。图7为该报告中的一部分，显示了两个厂家的二元比较图谱，同时色谱峰都自动标有化合物的名称，结果一目了然。

实验结果

采用UPLC与Q-TOF联用对两个厂家的双黄连口服液相关成分进行数据采集。采用UNIFI天然产物整体解决方案中二元比较工作流程并结合UNIFI中药数据库进行数据处理，结果明确显示了两个样品中相同组分图，差异组分图以及每个样品的特有组分列表。两个厂家样品二元比较的结果显示厂家一的口服液中连翘酯苷A、连翘酯苷B、右旋羟基连翘酯苷A、牛蒡苷、芦丁等的含量远高于厂家二的口服液，而厂家二口服液中黄芩苷含量则较高。

小结

本文介绍了如何使用UNIFI天然产物整体解决方案中二元比较工作流程比较两个不同厂家双黄连口服液的成分异同。该工作流程以UPLC/Q-TOF数据采集为基础，辅以中药数据库并结合UNIFI中的结构自动鉴定功能。此方案适用于不同产地药材化学成分的异同、不同厂家产品的成分差异、同厂家不同批次产品的质量稳定性等需要对类似样品进行比较的情况。方案中含有预设的五个二元比较工作流程模板及一个与其相关的报告模板，使研究人员可以迅速找出差异，大大提高了中药科研与质量监控的有效性及工作效率，分析结果可为后期的质量监控和制定质量标准提供依据。