HPLC液相色谱分离可再现性及精确性很大程度上取决于洗脱液组成成分及相应混合溶剂。阅读此文会助您了解利用梯度量方案优化色谱分离技术方案。

与等度洗脱不同，在液相色谱分离技术领域中，梯度洗脱除液体流动速率之外，洗脱液成分随时间变化而变化。仅仅提高流量对加速梯度分析无所助益;同时，在等度洗脱方案过程中对均衡性要求严格。在梯度洗脱中，由于被洗脱物质在达到一定洗脱强度后才开始在色谱柱内运动。因此，分析时间长短、洗脱液按照何种速度输送洗脱物质无关紧要。即便是具有决定性意义的洗脱液成分也只是从特定时刻开始在梯度泵内混合、输送至色谱柱后才开始发挥作用，而在此之前液体中的物质不得不在色谱柱中发生迁移，即便流动速率极高。因此，必须流速及梯度洗脱必须始终保持相互协调。

图1 将梯度法洗脱移植到尺寸更小、更高效色谱柱时的参数换算

在保持流速不变的情况下，缩短色谱柱长度会加速梯度洗脱分析速度，准确按照新色谱柱缩短比例系数加速。若在梯度洗脱法中换用一根较短色谱柱，必须按照相同色谱柱缩短比例提高洗脱梯度。

准确考察梯度洗脱量

将梯度洗脱转移至另一种流速或另一种尺寸规格的色谱柱进行考察是对梯度洗脱方案的最好帮助。如何定义梯度洗脱量?梯度洗脱量V_G是移动相总量，为梯度相时泵送至色谱柱总流量。它是流动速率F与梯度(以及在分级梯度或者多级梯度中的一个梯度区段)持续时间t_G之积。梯度量方案意义中第一条规则便是：改变给定色谱柱中流率时必须始终保持梯度量恒定。V_G=F×t_G=常数

它简要讨论了梯度法中相关流动速率与洗脱质量的关系，也就是色谱分离与流动速度之间的关系。原则上梯度洗脱具备最佳流动速率，相当于等度洗脱试验时在范德慕特曲线中测定的最小值;尽管梯度法不要求特定塔板数或塔板高。若梯度法中要求在不同于最佳流动速率的情况下洗脱，带给洗脱的负面效应明显较小。当移动相经过色谱柱时，由于洗脱力不断增加使得移动相中物质被永久洗脱于色谱柱区域之中。该效应抵消了通常的谱带增宽，也使得流动速率变化时，梯度法洗脱稳定性明显优于等度洗脱。在严格遵守梯度法方案的情况下，用户也可以鼓起勇气对更高流动速率应用可能性进行测试。

第二条规则是专门针对将梯度洗脱应用于其他尺寸规格(典型的是更小尺寸规格)色谱柱规则。在梯度洗脱方案中，该规则表示：在移植梯度洗脱法时必须保证梯度量V_G与色谱柱容积V_C比值恒定不变。色谱柱容积按照色谱柱尺寸(内径di与长度L)进行计算。

图2 脂肪酸-苯甲酰梯度洗脱时V_G/V_C变化的实例(色谱柱尺寸：4×150 mm，V_C=1.88 mL)

遵守该规则后可将梯度法应用于其他高效色谱柱之中，而且无需对峰值分辨率进行改动，色谱图也不会有大变动。重要前提是：具有其他尺寸规格色谱柱及等效填料。对此，各色谱柱生产厂家能够为您提供帮助。图1中再次就这些梯度洗脱方案规则给出实例。

协调方式确保最佳效果

该方法特色之处是其加速效应：当色谱柱尺寸规格、固定相填料粒度、流动速率及梯度曲线优化至最佳时，能够明显加快色谱分离效率，例如，初始条件：色谱柱长度250毫米，填料粒径5微米，按照梯度曲线运行，该曲线线性上升持续时间为10分钟。

按照基本规则，梯度法首先将流动相输送至一根较短的、更高效的3微米粒径填料色谱柱之中进行预处理。

由于填料颗粒直径从5微米减小至3微米，因此，色谱柱长度也按照相应比例缩短至150毫米。根据范德慕特理论，流动相也应按照该比例加速在色谱柱中流动。为了节约使用溶剂、避免过高流动速率，色谱柱直径也从4.6毫米减小至2.1毫米。怎样按照梯度曲线进行调整以确保符合梯度量方案呢?流动速率的新目标需按照初始流动速率、填料粒径、色谱柱直径的比例按下式进行调整：

在本例中，新流动速率目标值为0.5 mL/min。由于色谱柱直径明显变细，相当于初始流动速率三分之一流动速率下色谱柱的线性流动速度u提高大约67%(从2.2 mm/s提高至3.7 mm/s)。

色谱柱容积需按照内径4.6 mm、长度250 mm及内径2.1 mm、长度150 mm圆柱体容积计算。由此具备定义新型梯度曲线所需的所有参数值。

根据图1中所给出公式可计算出：新型梯度洗脱速度从原来的10分钟缩短至目前的3.6分钟。在其他的梯度区间(色谱柱的冲洗和平衡)之内也按此比例参数进行配置。

现代的色谱数据系统CDS，例如，Thermo Scientific Chromeleon 7.2 CDS均已在软件编辑器中集成相关换算助手，从而能够快捷、舒适及不出错的完成LC影响色谱分离方案移植、加快液相色谱分离速度。另外，网络上的转换计算器同样十分诱人。

梯度应多么“陡峭”?

在开发一项新洗脱方案时，多大梯度容积VG最合适?有迹象表明：该项新方案与需实现目标具有密切关系。同时，还需要区别三种不同情况。其中，与所用色谱柱容积V_C之间的比例十分关键。

当梯度容积较小时(V_G≤5×V_C)，得到洗脱峰形状十分陡峭。说明洗脱峰分析物浓度相当高，探测器中信噪比很好，但分辨率较低。该种情况适用于在中等复杂程度样本中微量元素的检测分析。容积大约是色谱柱容积V_C的6倍到15倍的中等梯度容积V_C在分辨率和洗脱时间两者之间折中。该梯度容积范围适用于常规液相色谱分离方案开发与设计。

当梯度容积较大时(V_G5×V_C)建议在复杂多组分洗脱分析中使用，会产生相当高峰值容量，但所需时间较长。当梯度容积V_G=30×V_C时，则几乎不会带来分辨率增益。

　　最后的例子能够清楚说明梯度容积对色谱图形的影响，图2表示：在常量色谱柱中通过改变t_G和/或F而对V_G/V_C比值产生影响。随着V_G/V_C比值的减小产生了下列影响：峰宽变窄，峰高增加，常规分辨率下降，分析时间缩短;特定双峰之间的选择性发生变化。

　　比较图2中a)及b)两图可看出：当V_G/V_C比值大于5时，总分辨率相对稳定;较小V_G会明显加快洗脱速度。相对保留时间的改变可以在较小(杂质)峰值物质及分辨率中识别出来。方法c)中仍能够看出主要成分，但它明显缩短了洗脱时间、节约稀释剂用量，但不能从中识别出杂质成分。