【干货】如何选择PCR 相对定量的内参基因

赵敏 2020-12-11

荧光定量 PCR 的主要用途之一即是相对定量，而提到相对定量，必然离不开内参，那什么是内参基因，为什么相对定量必须使用内参，如何选择正确的内参基因？我们今天就来聊聊关于内参的那些事。

一、什么是内参？

内参基因，也称为管家基因，其编码蛋白是维持细胞基本生命活动所必须的蛋白质。 它的表达水平不受任何内源性与外源性因素的影响。管家基因高度保守且在大多数情况下持续表达，稳定表达于不同类型的细胞和组织中。

二、为什么相对定量必须使用内参？

那内参基因与相对定量又有什么样的关系呢？我们通过以下实验案例一起了解一下。

实验目的：测定肝癌细胞 X 基因相对于正常肝细胞的表达量。通过荧光定量检测可得：肝癌细胞中 X 基因的C_T = 25，正常肝细胞中 X 基因的 C_T = 26，所以，利用表达量倍数计算公式2^-△CT 计算，发现肝癌细胞中的 X 基因表达量是正常肝细胞表达量的 2 倍。

但是，上面这个定量结果检测有效的前提是：必须保证两盘细胞的细胞数量完全一致；RNA 提取、逆转录以及定量效率及操作必须完全一致；不存在操作误差等。这显然是无法达到的。

那如何才能使这些误差不影响 X 基因表达检测的真实性呢？

这时，为了将样本处理归一化，引入一个内参进行校正。基于前面对内参基因特点的描述，我们知道内参基因在两类细胞（正常肝细胞/肝癌细胞）中的表达量是相对一致的，所以可以对细胞上样量、细胞上样过程中存在的误差、实验过程中存在的实验误差等进行校正。再来看一下引入内参后 X 基因的表达量。

肝癌细胞 X 基因 C_T = 25，内参基因 C_T = 20；正常肝细胞 X 基因 C_T = 26，内参基因 C_T = 22。所以，内参校正后，肝癌细胞中的 X 基因表达量是正常肝细胞表达量的 1/2 倍（计算公式 2^-△△CT）。

由此可见，若想有效检测一个特定基因的相对表达情况，选择内参进行归一化处理非常重要！

三、内参基因应具备的条件

理想的内参基因应该满足以下条件：

①不存在假基因 (p seudogene) ,以避免基因组 DNA的扩增；

②高度或中度表达 ,排除太高或低表达；

③稳定表达于不同类型的细胞和组织 (如正常细胞和癌细胞 )，而且其表达量是近似的，无显著性差别；

④表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关；

⑤ 其稳定的表达水平与目标基因相似；

⑥不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的影响。

排除内参基因的条件则为：

①在正常和异常的细胞/组织中的表达存在差异；

②呈现细胞周期依赖的表达；

③定位于X染色体。

内参基因通常是各种看家基因，在细胞内组成性表达，有助于保持细胞的功能。看家基因在某些类型细胞中的表达是恒定的，但在其他类型的细胞中则是变化的，尤其是与恶性疾病相关的临床标本。常用的人类内参基因见表 1。

（内容来源：生物学霸网络由小析姐整理编辑）

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