PCR- 核酸飞行时间质谱系统检测新型冠状病毒方法的建立及应用研究

赵敏 2021-05-07

应用MALDI-TOF MS原理，在Clin-ToF-Ⅱ飞行时间质谱系统上，建立了PCR-核酸飞行时间质谱检测SARS-CoV-2的方法。并通过对 COVID-19 疑似患者的核酸样本进行检测，评价检测性能及实际应用价值。通过对痰液和咽拭子两种样本的检出率，PCR-TOF MS法分别为100% 和85.45%，高于荧光定量PCR法的64.00%和43.64%。阴性样本两种方法均检测为阴性。

新型冠状病毒肺炎在全球暴发，实验室检测结果是疾病诊断的重要依据，检测方法的灵敏度和特异性是影响实验结果的关键因素，现荧光核酸检测方法是新冠病例确诊的通用方法，但其检测灵敏度有方法局限性，依赖标本病毒含量。通过对PCR-核酸飞行时间质谱检测方法的优化，从而提高对低新型冠状病毒（SARS-CoV-2）含量病例检测的灵敏度，可为现有方法做有效补充。

应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）原理，在Clin-ToF Ⅱ飞行时间质谱系统上，建立PCR-核酸飞行时间质谱系统检测SARS-CoV-2的方法，并评估其实际应用价值。

本研究收集上海市临床检验中心室间质评数据阳性40份、阴性7份，国家卫健委室间质评数据阳性41份、阴性33份。本实验室购买阳性质粒及稀释样本32份，健康人样本28份，空白对照超纯水5份，共 186 份样本作为建立PCR-核酸飞行时间质谱系统及判读标准的数据，并于2020年1-2月收集的安徽省内临床送检到安徽省疾病预防控制中心的疑似COVID-19患者上呼吸道样本80份（咽拭子样本55份、痰液样本25份）及健康人群样本20份（均为咽拭子样本）作为评估PCR-核酸飞行时间质谱系统效果的数据。

建立PCR-核酸飞行时间质谱系统试验体系步骤，包括PCR扩增、虾碱性磷酸酶（SAP）消化、单碱基延伸和质谱检测；并基于阳性质粒优化模板量。根据186份样本检测质谱峰的信噪比（SNP）确定该方法在SARS-CoV-2检测时的判读标准。对80份疑似SARS-CoV-2病例样本和20份健康人群样本进行检测分析，并与实时荧光定量PCR法进行对比。

建立的PCR-TOF MS反应体系可以对SARS-CoV-2 核酸的开放读码框1ab（ORF1ab）基因和核壳蛋白（N）基因进行有效扩增检测。通过对PCR-TOF MS模板条件的优化，模版量6 µl时，扩增产物可获得典型的质谱峰图（图1）。本研究PCR-TOF MS方法对临床疑似病例样本的检出率为90.00%，高于实时荧光定量PCR的75.00%。同时结果显示，实时荧光定量PCR法检出中含有25%的可疑结果，而PCR-TOF MS 则无可疑结果（表1）。对于痰液和咽拭子两种样本的检出率，PCR-TOF MS法分别为 100% 和85.45%，高于荧光定量PCR法的64.00%和43.64%（表2）。阴性样本两种方法均检测为阴性。

通过PCR技术与飞行时间质谱技术的结合，使得检测SARS-COV-2目标片段指数级扩大，从而提高样本的检测灵敏度。MALDI-TOF MS技术通过对离子分子量的检测分析，具有较高的准确性和特异性。研究同时证实了痰液样本优于咽拭子样本，PCR-核酸飞行时间质谱方法可作为实时荧光定量PCR法的补充和协同，在一定程度上有利于弥补假阴性的问题，从而降低临床漏诊率，提高检测效率，为疫情的研判缩短时间。

本研究应用MALDI-TOF MS原理，在Clin-ToF-Ⅱ飞行时间质谱系统上，建立了PCR-核酸飞行时间质谱检测SARS-CoV-2的方法。并通过对 COVID-19 疑似患者的核酸样本进行检测，评价检测性能及实际应用价值。

PCR-核酸飞行时间质谱方法可应用于SARS-CoV-2核酸检测，有较好的特异性和敏感性，样本检出率高于实时荧光定量 PCR 方法，尤其对实时荧光定量 PCR 报告疑似样本有较高的阳性率，可明确判断结果，降低漏诊率。在现有SARS-CoV-2临床诊断及密切接触者确诊环节中，存在大量可疑样本需要实验室检测的多次验证，该方法的建立大大提高了检测效率，减少了实验室重复验证的过程，更早地提供了实验证据，也为疫情研判缩短了时间。

样本的病毒含量、标本类型、试剂盒质量、采样方法，样本运输等问题均可能导致核酸检测结果不准确，且容易出现“假阴性”现象，本研究通过对咽拭子和痰液标本的检测结果分析，发现无论是实时荧光定量PCR法还是PCR-核酸飞行时间质谱法，疑似COVID-19病例的痰液样本阳性检出率明显高于咽拭子样本，且假阴性率低于咽拭子样本。这与SARS-CoV-2 易于在下呼吸道繁殖生长相吻合，提示样本采集应尽量采集下呼吸道标本。

飞行时间质谱技术在应用方面不仅可以进行蛋白质多肽检测、微生物鉴定、糖基化检测，同时还可以进行基因的SNP、突变、甲基化及拷贝数变异（copy number variation，CNV）分析。在临床检测领域，其基因检测的功能还未得到充分的开发，但鉴于其灵敏度高、特异性强，检测成本低、高通量和高准确性等特点，在核酸检测方面具有广阔的应用前景。

内容来源：质谱组学

责任编辑：展源

审　　核：何发

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