1、概述

药用辅料是指药物制剂中除主药以外的一切成分的统称，包括药品的赋形剂和其他附加剂，为了改善药品的安全性、有效性、稳定性、依从性等而加入的物质。在药物制剂反向工程，以及药用辅料安全评估研究中，药用辅料检测方法尤为重要。由于大多数药用辅料没有紫外吸收，用HPLC检测，除了使用常用的UV检测器外，还需联用ELSD、CAD、MS等通用型检测器。

中国药典收录的药用辅料，例如阿司帕坦、聚甲丙烯酸铵酯Ⅰ、聚甲丙烯酸铵酯Ⅱ、DL- 苹果酸、富马酸、明胶空心胶囊、大豆磷脂、蛋黄卵磷脂等均应用HPLC 法检查有关物质；β- 环糊精、胆固醇、麦芽糖等均应用HPLC法测定含量。随着我国药用辅料品种迅速增加及药用辅料的检测标准逐渐完善，结果精准、操作简便的HPLC 法得到广泛应用和发展。

2、HPLC-UV法

紫外检测器用于检测具有特定吸收波长，并在该波长下响应值（A）与浓度（C）成正比的物质。许多药用辅料如醇类、酮类、酯类、酚类等都具有紫外吸收性质，因此针对这类辅料HPLC-UV是首选方法。

苯甲醇是注射剂中常用的抑菌剂，但过量苯甲醇可对人体产生毒副作用，如静脉注射刺激性、鞘内注射神经毒性、过敏反应等不良反应。通常药典收录苯甲醇的检测方法是GC方法，文献[1]建立HPLC-UV法测定盐酸林可霉素注射液中苯甲醇的含量。采用DiamonsilC18 色谱柱，以0.05mol/L 硼砂溶液-甲醇-乙腈（67:33:2）为流动相，检测波长为214nm。结果在0.01903～0.32572mg/mL与峰面积线性关系良好（r＝0.9999），平均加样回收率为100.6%.

柠檬黄、苋菜红等是常用的人工合成色素，主要用作胶囊壳和糖衣的着色剂。收载于中国医药行业标准中。原标准采用三氯化钛滴定法测定含量，操作繁琐费时，测定结果误差较大。采用AgilentZorbax SB-C18 色谱柱，文献[2]以甲醇-0.02mol/L乙酸铵溶液（20:80）为流动相，检测波长为226nm，柠檬黄线性范围为0.050～1.000μg/ml（r＝0.9999），平均回收率为99.9%。

3、HPLC-RID

示差折光检测器（RID）是一种最早应用于HPLC 的通用型检测器。其在聚合物、糖类、有机酸、甘油三酯、高分子化合物、脂肪烷烃等物质测定方面具有独特的优势。辅料中糖类、酯类物质种类多，用途广泛，因此HPLC-RID法在药用辅料检测中也发挥着重大作用。

麦芽糖在药物制剂中可作为等渗调节剂、黏合剂、赋形剂等。日本药局方ⅩⅣ版、USP30版均已收载，并采用强酸性阳离子交换柱测定。但这种填料的色谱柱价格昂贵、保存难度较大、柱效易降低，检测器温度过高，研究成本较高。针对糖类，安捷伦Zorbax碳水化合物柱可将8种糖完全分离，且检测限为10ng。如图1所示。

图1 核糖、鼠李糖、木糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖依次在捷伦Zorbax碳水化合物柱分离色谱图

单硬脂酸甘油酯在药物制剂中常作为固体酯质纳米粒的骨架材料或非离子型乳化剂，是制备胶囊的材料之一，也常被用作稳定剂、润滑剂和增塑剂。虽然是一种常用的药用辅料，2015版中国药典却未收载。GB15612-1995 标准中的单硬脂酸甘油酯的含量测定方法是化学滴定法，此方法步骤繁琐费时，影响因素多，测定结果的不够准确。

文献[3]建立了HPLC-RID法测定单硬脂酸甘油酯的含量。采用Waters Sunfire C18色谱柱，以四氢呋喃为流动相，因其在紫外检测器中没有吸收，故采用RID。所建方法灵敏度高，简便快捷，适用于单硬脂酸甘油酯的含量测定和质量控制。

RID是通过比较折光率的变化来检测流动相中的样品峰。对于无紫外吸收或只有紫外末端吸收的物质，用HPLC-UV检测时灵敏度相对较低，同时易发生基线噪音大，而用HPLC-RID法可取得较为理想的结果。

但是RID 对多数检测物质（除糖类检测限可达1×10^-8g/mL）检测灵敏度较低（约1×10^-5g/mL），对环境温度、流动相组成的微小变化非常敏感，必须控温，且不适于梯度洗脱，这些固有的缺陷在某种程度上限制了其应用。

4、HPLC-ELSD法

目前蒸发光散射检测器（ELSD）越来越多的作为通用型检测器用于HPLC。其最大的优越性在于能检测不含发色团的化合物，如：碳水化合物、脂类、聚合物、未衍生脂肪酸和氨基酸、表面活性剂，并能在没有标准品和化合物结构参数未知的情况下检测未知化合物。这些优势为其在药用辅料检测应用奠定了良好的基础。

聚山梨酯-80是一种非离子型表面活性剂，广泛用作药用辅料中的乳化剂和增溶剂。目前国内外均有临床安全性问题报道。中国药典收录了比色法测定聚山梨酯-80含量的方法。虽然该方法对于设备要求较低，但其耗时较长，准确性及重复性较差。

文献[4]建立了HPLC-ELSD法测定莪术油注射液中聚山梨酯-80 的含量。采用TSK-GELG2000 SWXL 色谱柱，20mmol/L乙酸铵- 乙腈（90∶10）为流动相。该测定方法线性范围较宽，线性关系良好（r＝0.9978），加样回收率为102.5%（RSD ＝0.60%）。本方法快速、准确、稳定，可用于莪术油注射液中聚山梨酯-80的质量控制。

卵磷脂是一种天然的两性表面活性剂，化学名称为磷脂酰胆碱。在药物制剂中常用作乳化剂、增溶剂。中国药典有收录蛋黄卵磷脂中磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的检测方法。用硅胶柱为填充剂，以甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（85:15:0.45:0.05）为流动相A，以正己烷-异丙醇-流动相A（20:48:32）为流动相B，梯度洗脱，检测器为蒸发光散射检测器。

目前也有用C18/C8/C4为固定相，以甲醇-水-三氟乙酸为流动相的反相色谱体系，蒸发光散射检测器检测。

ELSD 对所有不挥发溶质都有响应，是一种较理想的通用检测器。相比于同为通用型检测器的RID，其灵敏度高，检出限约为10 ng，不受溶剂成分及温度波动的影响，亦可用于梯度洗脱。其最大的缺陷在于其流动相需采用挥发性的盐（如醋酸盐、甲酸盐），对于一些挥发性比较强的成分，可能在较高的温度下会随着流动相挥发成气体状态，不适于用HPLC-ELSD检测。

5、HPLC-MS法

MS是强有力的结构解析工具，能为结构定性提供较多的信息，作为理想的色谱检测器，不仅特异性强，而且具有极高的检测灵敏度。LC-MS联用技术突破了过去对含量低、不易分离或缺乏紫外吸收的物质难于检测的瓶颈，成为药物鉴定分析的重要研究手段。不需衍生化步骤，可以直接分析不挥发性化合物、极性化合物、热不稳定化合物和大分子化合物。以上MS的优势也成为了其在药用辅料检测中得到迅速推广。

邻苯二甲酸二辛酯（DOP）为一种药用辅料塑化剂。在肠包衣的片剂类、乳剂类和缓释类药品中使用。若长期服用可能引起生殖系统异常、甚至造成畸胎、癌症的危险。

文献[5]建立了LC-MS检测硫酸亚铁缓释片中邻苯二甲酸二辛酯含量。采用Waters BEH C18 色谱柱，流动相为95% 甲醇-5% 乙酸铵溶液梯度洗脱，质谱采用电喷雾离子源，多反应监测模式（正离子）。所测结果DOP 在0.0913～ 0.9130ng 内与峰面积线性关系良好（r＝0.9973）；以加标样品计算，在低、中、高3 个浓度水平下，DOP 平均回收率为98.5%，定量限为0.05ng，检测限为0.01ng。

本方法采用多反应监测模式，显著提高了检测的灵敏度和专属性，且样品处理操作简便、快速，适用于硫酸亚铁缓释片中DOP的含量检测。

糖醇也称为多元醇，这类物质是糖的还原产物，糖醇在药物制剂中常用做辅料，充当矫味剂和填充剂等。糖醇本身在紫外区域或可见光范围没有吸收，也无荧光，采用HPLC-RID 测定糖醇时，定量水平仅为0.1g/L数量级。

若通过衍生化的方法将样品组分制备成具有紫外吸收或能发出荧光的物质，用紫外、二极管阵列或荧光检测器，分析灵敏度可大大提高，定量水平达到0.01g/L数量级，但样品制备操作繁杂。

LC-MS法对进口碳酸钙咀嚼片中的辅料单糖醇进行分析鉴定，色谱柱为Hypersil NH2 柱，流动相为乙腈- 水（80 ：20），定量水平可达到0.1mg/L数量级。

随着MS 技术的成熟与开发，复杂基质中样品的原位与直接分析，多样品的结构解析，有关物质的分析等都是MS 的主要应用方向。这些应用方向均与提高药用辅料质量标准的要求相契合。

高效液相色谱- 电感耦合等离子体质谱联用技术（HPLC/ICP-MS）作为微量元素的测定最有效的途径之一，HPLC 高分离度与ICP-MS低检测性、宽动态线性范围及能同时测定多种元素、跟踪元素的变化等特点融合，目前已广泛的用于食品、环境、体内外药物分析中微元素的测定。

该方法应用于药用辅料中微量元素砷、汞、铬等检测的探索性研究项目已在试验室开展，随着技术的成熟与仪器的发展，其在药用辅料检测中有着广泛的应用前景。

高效液相色谱-核磁共振联用技术（HPLC-NMR）因仪器昂贵，NMR 灵敏度相对较低，液相色谱需使用氘代溶剂，溶剂信号易对样品产生干扰等，使其在药物分析中广泛应用存在一定障碍，但NMR 在结构分析方面有独特的优势，能够提供最丰富的结构信息，弥补HPLC通用检测器只能得到非常有限的结构信息的不足，在实际药用辅料杂质分析中已进入使用阶段。

7、小结

综上，HPLC与不同检测器的联用，可以应用于不同种类的药用辅料分析，并且各具优势。HPLC法在药用辅料分析中正逐步取代某些原有的繁琐的化学反应测定、不精确的比色测定等，在药用辅料分析中发挥重大的作用。随着辅料质量标准的提高与检测制度的完善，新型色谱、光谱、质谱、核磁共振的方法以及各种联用技术的开发与应用是未来的必然趋势。