His标签蛋白纯化问题解析

赵桂芝 0 2022-02-18

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蛋白纯化

His标签是蛋白纯化中经常会用到的标签，但是很多小伙伴在做蛋白纯化时会遇到各种问题，这里小析姐就总结了常见的一些问题。通过His标签纯化的蛋白，杂质比较多？

可能原因1：蛋白酶会部分降解目的蛋白

解决方法：加入多种蛋白酶抑制剂改进。

可能原因2：杂质蛋白与镍柱亲和力较强

解决方法：可提高杂质蛋白与镍柱结合起始咪唑浓度。

可能原因3：杂蛋白和目的蛋白结合

解决方法：可通过超声前加入去垢剂或者还原剂消除（1%-2%Tritonx-100）。

可能原因4：洗涤不充分

解决方法：增加洗涤的次数，充分洗涤。

融合蛋白不挂金属螯合亲和层析柱？

可能原因1：超声的功率不对（太大，蛋白炭化，太小，蛋白没有释放）

解决方法：改变超声功率或超声前尝试添加溶菌酶增加细胞破碎率。

可能原因2：组氨酸标签暴露不完全

解决方法：在变性条件下（用4-8 M 脲，或4-6 M 盐酸胍）进行纯化，常规Ni-6FF(IDA) ，在变性条件下镍离子容易脱落，此时可选择耐受变性剂的螯合填料（推荐月旭材料的亲和填料Ni Tanrose FF(NTA)）。

可能原因3：His标签丢失

解决方法：

1.WB 检查His是否表达，上游构建，改变His-tag的位置(C- 端或N- 端)，必要时增加His个数；

2.孵育的时间不够，降低流速和增加孵育的时间；

3.改变螯合的金属离子，寻找到最佳的结合金属离子；

4.选择高载量高特异性的螯合填料（月旭材料的亲和填料 Ni Tanrose FF（IDA) )。

使用几次后Ni柱载量下降，挂柱效率低，如何处理？

可能原因：逐渐积累沉淀，变性或非特异结合的蛋白占据了有效的结合位点，而通过洗脱液无法彻底清洗所致

解决方法：

较温和的清洗方法：用2倍柱体积的6M盐酸胍或8M尿素洗涤，然后用5倍体积的缓冲液洗涤，以去除沉淀或变性物质。用2倍柱体积的1% Triton X-100洗涤，然后用5倍柱体积的缓冲液洗涤，以去除疏水结合的物质。若改变不明显，可选择强烈清洗方式。

强烈清洗方式：首先用5-10倍柱体积的脱镍缓冲液（20 mM 磷酸钠, 0.5 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7.4）洗涤，进行脱镍操作，然后用5－10倍柱体积的平衡缓冲液冲洗，最后用5－10倍柱体积的双蒸水冲洗；随后进行清洗操作，去除离子型杂蛋白，可以用5倍柱体积的1.5 M NaCl溶液，然后10倍柱体积的双蒸水冲洗；去除沉淀或变性蛋白，可以用1M氢氧化钠溶液，结合1－2小时，然后用10倍柱体积的平衡缓冲液和10倍柱体积的双蒸水迚行冲洗；去除疏水蛋白或者脂蛋白，可以用5－10倍柱体积的30%异丙醇溶液清洗，然后10倍柱体积的双蒸水洗涤；最后进行生镍操作，用0.1M硫酸镍上柱，随后5倍柱体积的双蒸水和平衡缓冲液迚行洗涤，如需保存，保存在20%乙醇溶液。

融合蛋白结合在螯合填料上洗脱不下来？

可能原因1：洗脱条件太温和（融合蛋白质仍然结合在柱上，结合力较强）

解决方法：增加咪唑的梯度洗脱或降低pH来找出最佳的洗脱条件。

可能原因2：降低pH的方法洗脱，若pH低于3.5，会导致镍离子脱落

解决方法：改变洗脱办法，咪唑竞争性洗脱。

可能原因3：蛋白已沉淀在柱上

解决方法：

1. 减少上样量，或使用咪唑的线性梯度而不是分步洗脱以降低蛋白的浓度。试用去污剂或改变NaCl的浓度，或在变性条件（去折叠）下洗脱（用4-8 M 脲，或4-6 M 盐酸胍）；

2. 蛋白在柱上变性固化，用0.5M氢氧化钠洗柱。

可能原因4：非特异性疏水或其他相互作用

解决方法：加非离子去污剂到洗脱缓冲液（如：2% Triton X-100）或增加NaCl的浓度。

可能原因5：在填料表面形成高密度融合蛋白的聚集

解决方法：选择合适载量的填料，切勿一味追求高载量。

使用过程中发现堵塞严重，且流速越来越慢？

可能原因：样品中细胞碎片或其他杂颗粒所致

解决方法：样品处理过程中，高速离心，最好用0.45um的滤膜过滤（推荐）。如果柱子堵塞严重，重生时使用1% Triton X-100/PBS浸泡过夜。流速慢，可在柱子下面接一根软管。

镍柱使用中出现棕色是怎么回事？

可能原因：缓冲液中DTT的影响， DTT会对镍柱的颜色和纯化效率有很大的影响，在碱性的缓冲液条件下，镍离子会被DTT还原生成棕色的沉淀，所以要尽量避免DTT的参与

解决方法：若样品中含有DTT，在上样之前, 我们推荐采用不含还原性试剂的空白运行来除去任何较弱结合的镍离子；空白运行方法（使用不含还原剂的平衡液和洗脱液）

1）5倍柱体积的双蒸水洗柱；

2）5倍柱体积的平衡液洗柱；

3）5倍柱体积的洗脱液洗柱；

4）10倍柱体积的平衡液平衡。

当不使用时，勿将Ni Tanrose 6FF（IDA）保存于含还原性试剂的缓冲液中。

上清浑浊，是用IDA好还是NTA好？

上清浑浊，推荐适当稀释上清，并再次离心或者过0.45um滤膜处理。Ni Tanrose 6FF（IDA）或Ni Tanrose 6FF（NTA）都可纯化。

填料是否可以重复使用？

可以使用多少次?如果维护的好的话，填料在其效期之内可以一直重复使用。如果每次都是纯化同样的蛋白就没有必要剥离掉镍离子重新挂镍，一般经过5-7次纯化之后可以进行脱镍和再生镍的操作。如果柱子反压高了，填料需要做彻底的在位清洗CIP，在清洗之前，为了避免金属盐的沉淀，需要剥离掉镍离子，然后再重新挂镍，清洗后保存在20％的乙醇中。填料的寿命因使用的环境，纯化的样品的特性，保存方式等都有直接关系。

（内容来源：月旭科技由小析姐整理编辑）

责任编辑：展源

审　　核：何发

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