【收藏】轻松搞定液相的常见问题
液相
HPLC
故障
高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法(正相与反相)、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法，这些方法在使用的过程中往往会遇到诸如鬼峰、基线漂移、拖尾、分叉峰、保留时间漂移、柱压过高等系列问题，如何解决这些问题呢?
高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法(正相与反相)、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法，这些方法在使用的过程中往往会遇到诸如鬼峰、基线漂移、拖尾、分叉峰、保留时间漂移、柱压过高等系列问题，如何解决这些问题呢?
保留时间漂移
1、温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定;
2、流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等;
4、流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定;
1、筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子;
2、存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子;
2、样品未从柱子中流出。可根据样品的化学性质改变流动相或柱子;
3、样品与检测器不匹配。根据样品化学性质调整波长或改换检测器;
10、检测器与记录仪超出校正曲线。解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。
1、泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理;
4、溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法;
HPLC分析中，在色谱柱正常，样品灵敏度足够，分析方法合适，色谱峰在出峰时间较短的条件下(不包括梯度)，峰型应对称而尖锐。但是，在对样品了解程度不够，方法不妥，样品处理方法及进样方式不合理下，会出现各种意想不到的问题，而对色谱峰难以作出合理的解释，尤其对于新手更是如此。下面根据本人几年工作的体会，提出一些看法，向同仁指教。色谱双峰指的是明是一种物质，但在色谱图中出现双峰，而表明含二种物质。我将这种情况分为四种原因。
如果你分析样品时发现每个色谱峰都双峰出现(出峰越快，双峰的可能性会减少)，尤其采用单一纯物质时，可以肯定色谱柱出问题-柱头受损或柱头固定相变脏或流失。如果进样量少，原来色谱柱正常，色谱峰的形状多为一大峰带一小峰，不一定拖尾，这一般应是柱头受堵，将色谱柱反过来接，用流动相冲洗或酸洗或其它溶剂，将堵在柱头的残留物冲掉，再反过来，一般情况下就行了。当然不反冲，正冲有时也会正常的。如果峰拖尾，双峰强弱相差不大，柱头固定相变脏或流失可能性更大，这是可以将进样那头拧开，将微孔滤片超声，柱头刮去一部分填料，重新填上新填料拧紧，不过这种活，需要一定技术，同时不能老干那种事，否则用不了几次，色谱柱就会应柱效很低而报废。
许多HPLC分析者对此可能不以为然，一般的HPLC的书籍和文献都不会提到这方面的内容，而这是双峰产生的一个很重要的原因。目前，HPLC分析多为反相色谱，流动相多为甲醇、乙腈、水，加各种添加剂以改善分离性能。样品一般用与流动相相溶的溶剂溶解。最佳的溶解方法是用流动相溶解，但是很多情况是不一致的。当用溶剂极性强度大的试剂，如，纯甲醇、纯乙腈，纯乙醇，而分析体系中以水为主，样品进样量大，如，定量管为20μL，此条件下完全可以肯定，单一的纯物质出双峰，第二峰比第一峰小(每次都不太一样)，且拖尾，保留时间会提前(相对进样量少而言)，将进样量减少一半以上，峰型将变为正常。这是样品的溶剂与流动相极性相差太大，而流动相来不及将其稀释达到平衡造成的。上面提到进样量造成双峰的一个原因，另一个原因是，进样量不一定大，但绝对量很大，色谱图上的双峰紧靠在一起，基本上齐高，不拖尾(如果出峰很快，也可能是色谱柱问题)。将样品稀释再进样就可以了，这是由于进样量过大，色谱柱过载造成的。
有些样品由于其化学结构的特点，存在互变异构现象，而这种互变异构体无法分开，而是以一个动态平衡存在。在色谱分析时，在一个特定的条件下，一种物质将出现双峰，双峰靠的很近，基本齐高，不拖尾，条件稍一变化，尤其pH，双峰现象将消失，如，红霉素等。有的样品紫外的色谱图上看不到双峰，但在LC-MS下，用质谱检测器，其质谱的总离子流图上较明显，例如，我分析过的农药啶虫眯(吡虫清)。
记录的参数一般都内定的，不必修改，但GC和HPLC的参数是不完全一致的，例如，c-r3a数据记录仪上的一般记录时间间隔GC为2MS，HPLC为5MS，如果记录间隔时间缩短，一个峰将变为二个峰或更多。
如果经常需要改变流路或更换不同品牌的色谱柱，使用peek材料制成的管路和接头会非常方便。peek管路容易连接;peek接头不仅无需工具，手拧即可固定，而且容易调节锥箍之外的管路长度，方便与不同品牌或规格的色谱柱相连接。
使用此类材料的管路需要注意的是：peek对卤代烷烃和四氢呋喃的兼容性不好。虽然未观察到上述溶剂溶解peek材料的明显迹象，但peek遇到上述溶剂会变脆。另一个西药考虑的因素是压力限。不锈钢管可耐受6000psi的压力，但peek管只能耐受近4000psi(但多数hplc应用系统压力不会超过3000psi)。
使用peek接头时则无需担心接头耐溶剂性能，因为接头几乎或很少与溶剂直接接触。但手拧固定的peek接头压力限低于不锈钢管，因而压力太高时，可能会使接头在管路上滑动而产生死体积或漏液。
许多色谱工作者在操作液相色谱时，色谱柱是在室温环境下工作的。如果实验室的温度能保持不变的话，不会有什么大问题。但大多数的工作环境温度是不断变化的，因此若想将在某实验室开发的一种液相色谱方法应用到其他实验室的话，温度的差别就会引起较复杂的问题。温度的影响在所有的色谱分析方式中都是存在的，本文就来讨论液相色谱方法中的梯度洗脱方式受温度影响的问题。
大多数色谱工作者知道等度洗脱时温度会影响保留时间。拥有温控系统的实验室一般都有全天候温控设置，但这种设置可能引起室温显著变化，这对整夜运行的色谱系统就会有一些影响，例如，我们实验室的夜间温度就设为4～7℃。在不同的季节，实验室的夜间温度可能比正常工作日的温度高或低，这种温度的变化就会使色谱峰离开“保留时间窗”，造成连续进样中产生一系列的无效数据。
还有一个可能的温度影响因素就是色谱仪器在实验室的位置。当色谱柱正对着空调的送风口时，虽然整个实验室的温度非常稳定，但色谱系统的温度就会不断的变化。这就是我们要使用柱温箱的原因之一。
温度变化对梯度洗脱和等度洗脱的影响趋势是一样的。若梯度洗脱时不控制温度的话，保留值一般都会有较大的变化。
我们发现柱温在液相色谱梯度洗脱过程中扮演了一个重要的角色，首先，提高柱温可以缩短保留时间，其次，我们看到柱温还可以影响选择性，最后，温度的不平衡会导致峰扭曲变形。这些提醒我们，如果想得到稳定可靠的分离结果，色谱柱的温度变化是不可忽视的。
①检查接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换密封。检查流通池是否漏液。
⑩维修或更换混合器，在流动相不走梯度时，建议不使用泵的混合装置
①样品体积过大--用流动相配样，总的样品体积小于第一峰的15%;
②在进样阀中造成峰扩展--进样前后排出气泡以降低扩散;
③数据系统采样速率太慢--设定速率应是每峰大于10点;
④检测器时间常数过大--设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%;
⑦保留时间过长--等度洗脱时增加强溶剂含量，也可用梯度洗脱;
⑧柱外体积过大--将连接管径和连接管长度降至最小;
改变流动相的组成或溶剂溶剂强度就可以改变峰容量因子和保留时间。在一定条件下，减少保留时间或缩短分析时间的溶剂为强溶剂，增加保留时间或延长分析时间的溶剂为弱溶剂。
在分析多组分样品时，仅改变流动相的强度(组成百分比)而不改变其组成，一般仅仅改变所有组分的保留时间，不会发生峰位的重排。
流动相中换了强溶剂;pH值的改变;柱填料的改变;柱温的改变;流动相的组成改变(如，加入离子对试剂三乙基胺等)。
在良好的色谱分离中，样品分子是以单一的保留过程被保留，如在反相色谱中，溶质与柱填料的非极性烷基链发生疏水性相互作用，但，在以硅胶为基质的填料中，有些样品组分能与硅醇基团相互作用，脱附的过程很慢，使峰严重拖尾，这就是次保留过程。对付次保留效应最有效的方法就是选用封尾更好色谱柱或加入流动相改良剂(也叫扫尾剂)。
因柱温问题很易引起前延峰，有些样品在常温下分离可见前延峰，提高温度后前延峰的现象消失。在离子对色谱中，前延峰的另一个原因是用非流动相作样品溶剂。因此在离子对色谱中要求仅用流动相溶解样品，而且进样量不要太大，否则会导致前延峰或其它问题。在rp-HPLC中样品溶液的强度大于流动相引起前延峰。增加流动相的强度，减少样品溶液的强度，在离子对色谱中增加离子强度，可以克服前延峰的效应。此外使用流动相溶解样品是解决的最简单实用的方法。
柱平衡慢的常见原因是，组分在旧的或新的流动相中对柱吸附强，或者，在新的流动相中浓度小甚至为零：
b.流动相含有离子对试剂;硅胶柱;流动相中有四氢呋喃。可考虑采用专用柱用于特殊的方法，不用时将柱折下来，注满适当的溶剂或流动相，密封保管，不再作其它的分析。
在HPLC分析中由于使用了高效微粒固定相及高压流动相，样品以柱塞式注入色谱柱后，因柱的阻力大，样品分子在柱中的分子扩散很小，直至它从色谱柱流出也未与色谱柱内壁接触，因而引起的色谱峰形扩展很小，能保持高柱效。
液相在使用过程中会遇到各种各样的问题，多操作多总结多归纳，掌握原理通则性的知识，解决问题就轻松了。
加载更多