微升级单细胞液滴筛选系统用于微生物高通量自动化单克隆培养与分选

互联网 0 2023-02-07

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清华大学生物育种技术与装备团队开发微升级单细胞液滴筛选系统用于微生物高通量自动化单克隆培养与分选。

单克隆菌落的分离、培养和挑取是微生物研究的关键操作。1881年，Robert Koch发明了在固体平板上进行微生物纯培养的方法，已经成为微生物单克隆培养和挑取的标准方法之一。然而在面对日益多样的高通量需求时，基于固体平板的方法由于通量低、培养基利用率低以及存在大量的人工操作，通常要消耗大量人力物力。虽然近些年也发展了一些整合菌落挑取仪、移液工作站等仪器与机械臂的自动化工作站，但这种平台复杂而昂贵。近年来液滴微流控技术的发展为自动化高通量微生物培养和筛选提供了新的解决方案。然而目前大多数相关系统使用皮纳升液滴，由于其体积小，导致检测方面诸如检测灵敏度低，高度依赖特定的化学试剂和探针，检测设备复杂昂贵等问题。同时这些系统通常以堆叠的方式培养液滴，较难单独和依次收集目标液滴，不能完全实现单克隆菌落的单独获取。

近日，清华大学化工系生物育种技术与装备团队在生物工程领域国际知名期刊Biotechnology and Bioengineering上发表了题为“Single‐cell microliter‐droplet screening system (MISS Cell): An integrated platform for automated high‐throughput microbial monoclonal cultivation and picking”的文章，论文通讯作者为张翀副教授。文章报道了一种自动化和集成化的微流控平台——微升级单细胞液滴筛选系统(MISS Cell)，可用于在2.0-2.5 μL的液滴中进行自动化高通量的微生物单克隆培养和分选，通量可达104。MISS Cell是一个高度集成的系统，主要由四个模块组成，包括进样模块、微流控芯片模块、液滴存储和培养模块以及液滴检测和收集模块。MISS Cell生成微升级单细胞液滴，在透气性培养盘中储存与培养液滴。培养完成后，通过光谱检测和特定算法进行液滴识别与基于OD检测的自动分选。MISS Cell采用特殊的机械结构，通过液滴打印的方式与标准化容器，如96微孔板、8联排PCR管等对接，实现液滴的自动化收集(图1)。

图1 MISS Cell的结构和原理示意图。(a)MISS Cell的整体结构;(b)液滴识别和OD检测的原理;(c)液滴分选和收集。

文章通过分离和培养用两种不同颜色荧光标记的同种细菌的混合溶液，验证了微升级单细胞液的产生。通过使用三种不同的混合菌液(mCherry和sfGFP标记的大肠杆菌，RFP和EGFP标记的谷氨酸棒杆菌以及mCherry和YPet标记的酿酒酵母)进行广泛的统计，发现将泊松分布λ控制在0.035-0.145之间时，可确保产生较多的单细胞液滴，其占总液滴的3.4%-12.6%。MISS Cell的适用范围包括常见的细菌、酵母、使用孢子繁殖的丝状真菌和放线菌等(图2)。

图2 MISS Cell中单克隆培养和分选的操作流程和验证结果。(a)固体平板方法和MISS Cell培养方法的操作流程比较;(b)单细胞液滴生成的原理和双色荧光菌体系验证原理;(c)使用红色和绿色荧光标记的大肠杆菌的验证结果，λ=0.086;(d)使用大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌和酿酒酵母进行验证的结果汇总。

文章首次系统地探究了微升级单细胞液滴的各项性能。MISS Cell中微升级液滴具有良好的体积一致性，生成液滴的体积变异系数为1.88%。MISS Cell对液滴及其挥发性底物具有优秀的保留能力，支持微生物的长期培养。和微孔板、深孔板相比，微升级液滴具有良好的培养性能和微生物生长一致性，有利于微生物的检测和筛选。和固体平板相比，微升级液滴培养前期生物量增长快于固体平板，有利于更早进行单菌落的挑取，缩短培养时间，提高工作效率(图3)。

图3 MISS Cell中微升级液滴性能表征。(a)生成液滴的体积变化;(b)液滴挥发情况;(c)液滴中底物(以甲醇为例)的挥发情况;(d)不同方法微生物培养的平行性;(e)微升级液滴和固体平板中单菌落生长速率比较。Scale bar = 400 μm。

分子克隆的培养和挑取是合成生物学的基本实验操作，通常使用固体平板进行。文章使用MISS Cell来培养和挑选分子克隆，并通过测序，根据测序峰图是否由单一或杂合峰组成，评估每个菌落的单克隆性。结果显示，来自MISS Cell的单菌落的测序杂合峰比例为5.52%和4.35%，与固体平板的结果(2.50%和4.12%)相似，且都低于某生物公司的长期实验数据(7.68%)。这进一步表明，MISS Cell中的微升级液滴培养物具有良好的单克隆性，可用于分子克隆的培养和挑取(图4)。

图4 MISS Cell中分子克隆的培养和分选。(a)使用MISS Cell和固体平板方法进行分子克隆的操作流程;(b)来自固体平板和MISS Cell的不同菌落的测序峰图;(c)使用不同的DNA连接产物的测试结果。

文章建立了基于MISS Cell的微生物诱变筛选工作流程，并对Corynebacterium glutamicum B2H001进行高谷氨酸(Glu)产量表型菌株的筛选。首先，使用常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma，ARTP)处理C. glutamicum B2H001获得突变体库。接下来使用MISS Cell对突变体进行培养，并进行单克隆菌落的分选。文章使用了一个基于强度的谷氨酸感应荧光报告器(intensity-based glutamate-sensing fluorescent reporter，iGluSnFr)进行Glu的特异性检测。文章在3500个液滴中分选收到502个单克隆，检测后选取了11株信号相对较强的菌株进行后续验证。最终验证得到的1J11和1P18突变体，摇瓶培养的谷氨酸产量分别提升了25.8%和19.1%。MISS Cell实现了关键流程的自动化，即单克隆菌落的培养和挑取，具有很高的通量，并省去了单克隆再培养的步骤，节省了人力物力和时间(图5)。

图5 C. glutamicum B2H001在MISS Cell中的筛选流程和结果。(a)MISS Cell和传统固体平板之间的菌种诱变筛选流程比较;(b)iGlusnFr检测Glu的工作示意图;(c)iGlusnFr对Glu的反应曲线;(d)使用iGlusnFr作为传感器在MISS Cell中培养的初始菌株的Glu产量时间曲线;(e)MISS Cell筛选和24深孔板的验证结果;(f)菌株1J11、1A2、1P18和1K1在摇瓶中的进一步验证结果。

综上，该研究工作开发的微升级单细胞液滴筛选系统(MISS Cell)自动集成化平台，可用于自动化高通量微生物单克隆培养和挑选。与固体平板法相比，MISS Cell具有更高的产量、更低的试剂消耗和更多的自动化操作，可以节省大量的人力和物力。与皮升级液滴相比，MISS Cell使用更简单的光学信号检测，同时可以精准识别液滴，使液滴可寻址(图6)。MISS Cell有望成为一个通用的操作平台，在高通量的应用场景中大大提高单克隆菌落的获取效率，解除固体平板在通量和操作上的限制，以促进生物技术发展。