将体外转录的 RNA 用作治疗药物需要大量具有低免疫原性的功能性 RNA。用于合成这些体外转录的 mRNA 的技术——主要使用 T7 噬菌体 RNA 聚合酶 (T7 RNAP)，这个技术目前已经很成熟。T7 RNAP 从包含噬菌体酶特异性启动子的 DNA 模板中以高保真度转录 RNA。尽管使用 T7 RNAP 从 DNA 模板合成 RNA 的过程很稳健，但之前的研究已经确定了体外合成过程中某些副产物的存在，这些副产物会触发细胞免疫反应，包括双链 RNA (dsRNA)，这已被证明成为免疫通路的主要触发因素。因此，在为寻求最小化细胞免疫反应的体内应用合成 mRNA 时，从 mRNA 制剂中消除这些 dsRNA 污染物或减少它们的形成是至关重要的。

01 这些dsRNA副产物是什么?

dsRNA 副产物的产生被认为主要通过两种不同的机制发生。首先，由 T7 RNAP 合成的 RNA 转录本(runoff转录本，图1)在后续几轮转录中作为 T7 RNAP 的 RNA 依赖性 RNA 聚合酶活性的模板[1]。如果runoff转录本的 3'-末端具有足够的互补性(在顺式中)，它将向后折叠并导致runoff转录本的延伸。生成的 RNA 将在 3' 端延伸，并且可以在凝胶上的变性条件下与主要转录物区分开来(图2A)。

图1 体外转录过程中 dsRNA 副产物形成的可能机制示意图

短的 RNA 片段，例如流产的转录物，可以退火到runoff转录物中的互补序列(反式)，并且还会导致 dsRNA 副产物的形成(图1B)。dsRNA 产物的身份和性质将根据延伸发生在顺式还是反式而有所不同，并且预计 RNA 积累与虚假产物的形成之间存在很强的相关性，因为合成的 RNA可能会重新结合聚合酶以启动延伸。

第二种dsRNA 副产物机制是RNAP 可能会切换到非模板链，从而产生与runoff产物互补但以启动子独立方式合成的 RNA 分子(图1C)[2]。由于反义分子的大小与runoff产物的大小相似，因此无法通过变性凝胶电泳进行区分。相反，分析由于存在反义 RNA 分子而形成的 dsRNA 副产物将需要天然条件(图2B)。

02 如何检测反应中的dsRNA副产物?

1)凝胶电泳法

以runoff转录本为模板、顺式或反式形成的dsRNA，其长度短于runoff转录本，在变性凝胶下可与目标转录本区分(图2A)。以DNA模板或非模板链为模板转录生成的runoff转录本或反义链，二者结合形成的dsRNA长度与runoff转录本一致，无法通过变性凝胶有效分离，可使用活性胶实现dsRNA与ssRNA的分离(图2B)。两种凝胶电泳法适用于不同副产物的定性检测，分辨率相对较低，不能精确地定量分析dsRNA残留量。

2)免疫印迹法

免疫印迹法利用dsRNA特异性抗体来检测IVT反应中dsRNA含量。J2抗体是一种抗dsRNA抗体，可特异性识别并结合dsRNA，根据特定信号鉴别样品中是否存在dsRNA(定性检测)，如图2C所示。同时制备合适的标准对照品，以定量分析待测样品的dsRNA残留，提高检测的灵敏度(图2E)。该方法依赖于抗体对dsRNA的特异性识别作用，而mRNA二级结构或修饰核苷酸可能改变抗体对dsRNA结构的识别，需进行专门的研究。注意：抗体检测的灵敏度与dsRNA区域的长度有关，需调整检测的灵敏度以确保dsRNA可被检测。

3)酶法免疫印迹法

是当前dsRNA检测的常用方法，可采用尼龙膜或商业化酶联免疫法(ELISA)试剂盒。使用尼龙膜上样需优化上样体积，以使各样品扩散程度一致，减少对结果精确度的影响。商业化试剂盒检测过程相对简单。以某ELISA试剂盒为例，基于双抗体夹心酶联免疫法，使用捕获抗体包被微孔板，形成固相抗体，向固相抗体微孔板中加入dsRNA校准品和待测样品，然后加入检测抗体，最后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的酶标二抗，形成“包被抗体-dsRNA-酶标检测抗体”复合物，经过洗涤后加入显色液显色，终止反应后使用酶标仪检测吸光值，吸光值与样品中dsRNA的量呈相关性。

4)MDA5特异结合法

胞质免疫受体MDA5是一种RIG-I样受体(RIG-I like receptors，RLRs)，可特异性识别dsRNA从而激活机体的抗病毒免疫反应，因此可根据MDA5与dsRNA的结合作用设计体外检测策略。首先，使用冷冻电子显微镜(cryo-EM)可观察到MDA5-dsRNA复合体存在短纤丝(filaments)，对短纤丝结构的分析显示，每个MDA5分子横跨14-15个RNA碱基对。但这一分析方法因低温 EM 分析的设备要求而受到限制。其次，MDA5是一种ATP依赖性解旋酶，MDA5与dsRNA的结合可激活MDA5的腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)水解酶活性，可可以通过标准生化测定法检测dsRNA。因此，在存在 MDA5 的情况下进行 ATP 水解的体外测定可能是了解目标 mRNA 产生的免疫反应程度的良好替代方法。

5)测序或质谱分析

为深入研究dsRNA的核苷酸序列，可进行RNA-seq2或完整分子的质谱分析(图2D)。两种方案的不足之处在于，RNA-seq分析过程中结构化RNA的连接偏倚可能影响实验结果，而质谱分析提供所选RNA的异质性分布，但无法提供RNA 3’端的序列信息。因此，两种分析方法并不通用，且在筛选多个序列时不能以高通量的方式进行。

图2 dsRNA 副产物的检测方法

A: 变性凝胶电泳; B: 活性胶电泳; C&E: 免疫印迹法; D: 质谱检测MS

由于免疫测定无法区分 dsRNA 产物是由于 3' 端延伸还是反义分子合成而形成，因此建议实施不止一种方法来表征副产物的性质，因为了解分子的性质可以指导采取何种方法来防止在 IVT 反应中形成 dsRNA 副产物(见下一节)。

03 如何减少IVT反应中dsRNA副产物的形成?

1)高效液相色谱 (HPLC) 纯化

高效液相色谱 (HPLC) 的纯化已被证明可以将 dsRNA 副产物与主要 IVT RNA 产物分离(图 3A)[3]。HPLC 纯化过程中 dsRNA 副产物的保留时间较长表明该方法可用于将 3'-扩展的 dsRNA 副产物与主要 IVT RNA 分离。这种方法虽然有效，但会导致 mRNA 合成工作流程中的额外步骤，涉及专门的仪器，与扩大反应不兼容，并阻碍了该方法的成本效益。

此外，尚不清楚这种基于 HPLC 的方法是否可以有效分离反义 dsRNA 产物，它们的分离可能取决于所使用的实验条件。还报道了基于 dsRNA 与纤维素的选择性结合，用于去除 dsRNA 污染物的基于纤维素的色谱方法[4]。尽管这种纯化策略具有成本效益，而且这种方法的一次性性质可以防止先前纯化的残留，但它可能并不适合所有 mRNA 序列，因为某些 mRNA 可能更倾向于形成二级结构这可能会降低恢复率。

2)使用耐热 RNA 聚合酶进行IVT 反应

合成后纯化的另一种方法是通过改变 IVT 反应条件来防止在中形成 dsRNA 副产物。降低 IVT 反应中的镁含量以减少一些特定模板[2]的 dsRNA 副产物(通过反义 RNA 的合成形成)的形成;然而，降低反应中的镁浓度也会影响 RNA 的总产量，这对于需要大量 mRNA 的应用来说是不可取的。

最近表明，添加与runoff转录本 3' 端互补的 DNA 寡核苷酸也可以防止 3' 延伸的 dsRNA 副产物的形成[5]，但在合成治疗性 mRNA 后去除这种寡核苷酸可能具有挑战性，并且需要额外的酶促步骤，这在试图简化工作流程和限制生产成本时是不可取的。

使用耐热 RNA 聚合酶，例如来自 New England Biolabs 的 HiT7® 已被证明可以减少 IVT 反应中 3'-延伸的 dsRNA 副产物(图 3B)的形成，而不影响总产量或RNA，并且它不需要额外的酶处理，这可以为当前的 IVT 反应工作流程提供替代方案[6, 7]。

最适合去除/预防 dsRNA 污染物的方法将取决于最终应用和所需的 RNA 产量规模。对于以放大为先决条件的应用，合成后纯化步骤可能会阻碍最终结果。更好的方法是防止在合成过程中形成 dsRNA 副产物。

图3 减少IVT 反应中 dsRNA 副产物。

04 未来展望

使用合成 mRNA 作为药物需要 mRNA 不含任何污染 RNA，并且需要大量合成。因此，在选择合适的方法去除 dsRNA 副产物以合成您喜欢的 mRNA 分子时，应尽早考虑 IVT 反应的最终应用和规模。dsRNA 副产物也是必须考虑的一个因素。例如，模板编码的 poly-A 加尾可以避免部分 dsRNA 副产物的形成，但不是全部，高温转录可以减少 3'-末端延伸的 dsRNA 副产物，但不能减少反义 RNA 的合成[7]。使用高产率反应条件来合成更大量的 RNA 对于需要放大的应用来说很有吸引力。然而，由于在存在过量 RNA 的情况下可以增强某些 dsRNA 副产物的形成，因此应考虑酶：模板：NTP 条件，并针对每个序列进行优化，以最大程度地减少这些 dsRNA 副产物的形成。DNA 模板或 RNA 分子中更容易形成 dsRNA 副产物的序列的性质尚不完全清楚。

更好地了解序列特异性有助于 mRNA 3'-末端的合理设计，以防止在反应中形成这些污染物。即使是模板序列和/或反应条件的微小变化也可能影响 dsRNA 副产物形成的程度，在设计/修改模板序列时应予以考虑。最后，在使用经过修改的 NTP 制作 mRNA 时，很难检测 dsRNA 副产物，在这种情况下，至少应采用一种以上的方法来表征和定量 dsRNA 副产物。

总之，用于治疗目的的合成 mRNA 的高效且具有成本效益的生产将需要对最终 mRNA 产品的性质有透彻的了解，并且将取决于能够最大限度地减少污染物产生的合成过程，否则将需要昂贵的纯化方法。

参考文献

【1】 Gholamalipour Y, Karunanayake Mudiyanselage A, Martin CT. 3’ end additions by T7 RNA polymerase are RNA self-templated, distributive and diverse in character-RNA-Seq analyses. Nucleic Acids Res. 2018 Oct 12;46(18):9253-9263.

【2】 Mu X, Greenwald E, Ahmad S, Hur S. An origin of the immunogenicity of in vitro transcribed RNA. Nucleic Acids Res. 2018 Jun 1;46(10):5239-5249.

【3】 Karikó K, Muramatsu H, Ludwig J, Weissman D. Generating the optimal mRNA for therapy: HPLC purification eliminates immune activation and improves translation of nucleoside-modified, protein-encoding mRNA. Nucleic Acids Res. 2011 Nov;39(21):e142.

【4】 Baiersdörfer M, Boros G, Muramatsu H, Mahiny A, Vlatkovic I, Sahin U, Karikó K. A Facile Method for the Removal of dsRNA Contaminant from In Vitro-Transcribed mRNA. Mol Ther Nucleic Acids. 2019 Apr 15;15:26-35.

【5】 Gholamalipour Y, Johnson WC, Martin CT. Efficient inhibition of RNA self-primed extension by addition of competing 3’-capture DNA-improved RNA synthesis by T7 RNA polymerase. Nucleic Acids Res. 2019 Aug 8. pii: gkz700. doi: 10.1093/nar/gkz700.

【6】 Roy B, Robb GB. Use of thermostable RNA polymerases to produce RNAs having reduced immunogenicity. US Patent 10,034,951.

【7】 Wu MZ, Asahara H, Tzertzinis G, Roy B. Synthesis of low immunogenicity RNA with high-temperature in vitro transcription.