1、平衡透析（ED）

ED是一种浓度驱动的过程，通过具有不同分子量截断点(MWCO)的选择性和可渗透性膜孔(如8K或12K MWCO)的扩散将小体积血浆中的游离蛋白结合药物分离出来。由于没有施加外力(如压力)，ED被认为是研究蛋白质相互作用的真实性质的黄金标准。

为了控制环境条件，在37℃下进行ED以模拟体内条件，最好在二氧化碳(通常为5%)控制的培养箱中进行ED以控制pH值。

传统的ED需要大量的等离子体和较长的平衡时间。为了克服这些缺点，可用下图这个装置，适合于高通量分析。由于膜室的高表面体积比，允许快速透析，大幅减少平衡时间，可以最大限度地减少体积移位和蛋白质泄漏等潜在问题。也减少了设备中的非特异性结合（NSB）。此外，由于透析实验的性质，我们假设NSB对ED中药物的非结合分数的影响可以忽略不计。NSB在血浆室和透析液室中均发生，达到类似程度后，将建立新的平衡，尽管浓度低于预期。

快速平衡透析(红色)装置。每个插入物由两个相邻室组成：(A)不同分子量截断点(MWCO)的O形密封圈垂直透析膜圆柱体，加入血浆；(B)加入透析液缓冲液；(C) 96孔底板设计48个插入。

快速平衡透析制样的优缺点：

快速平衡透析(RED)实验常规步骤：

2、超滤（UF）

UF使用具有指定MWCO值和离心力的低吸附性亲水膜，根据分子量和大小，将游离药物从蛋白质结合的药物中分离出来。与ED相比，UF更适合于高通量分析。

超滤法制样的优缺点：

超滤(UF)实验常规步骤：

3、超速离心（UC）

UC通过重力将大分子从小分子中分离出来。对于具有非常高NSB(疏水药物)的化合物或无法通过透析膜扩散的化合物，这可能是一种替代方法。

UC将血浆分为三层：(1)上层：含有极低密度脂蛋白；(2)中间层：无蛋白层；(3)底层：包含血浆蛋白。要分析的样品应该非常小心地(通过自动化过程)从中间层获取，以确保这些层不受干扰。

超离心法制样的优缺点：

超离心法（UC）实验常规步骤：

4、总结

当药物不存在血浆不稳定性时，ED将是首选的方法，因为它研究蛋白质相互作用的真实性质，尽管达到平衡需要较长的处理时间(约3~48小时)，但RED的使用大大减少了处理时间(2至6小时)，被认为是一个很好的替代方案。如果药物的不稳定性不能通过添加稳定剂来控制，那么高通量UF(96孔格式)将是首选的方法。在NSB是限制因素的情况下，可以使用UC，尽管它需要昂贵的设备和特殊的操作技能。

三种方法的优缺点

实验中需重点关注

1. 药物的非特异性结合(NSB)，

2. 整个样品处理过程中，包括从样品采集到长期储存的时间，

3. 环境条件(温度和pH值)的变化。

可以在停血后直接加入酶抑制剂(如氟化钠)，以尽量减少血浆中化合物的不稳定性。推荐的抗凝剂是乙二胺四乙酸(EDTA)，因为抗凝肝素可能干扰蛋白质结合。