分离度变小？柱效下降？两大理论解决相关问题
在离子色谱的使用过程中，您是否遇到过在标准相同条件下：
1、离子间的分离度变小；
2、峰的保留时间变短；
3、峰的对称性变差。
如果有这些现象，一般是您的色谱柱柱效下降了。那柱效如何衡量？如何判断柱效是否下降？如何提高分离度？今天，小析姐就先跟您从塔板理论和速率理论两个角度来了解一下相关内容。
“塔板理论”最早是由Martin和Synge于1941年提出来的，将一根色谱柱比作分馏塔，假设色谱柱内有很多塔板组成，在每一小段内，一部分是固定相，另一部分为流动相，组分随流动相进入色谱柱后，在两相间进行分配。引入理论塔板数或理论塔板高度作为衡量色谱柱效率（柱效）的指标。
要实现分析组分在两相间的分配行为就要先满足以下假设：
● 色谱柱中存在高度为H的塔板（理论塔板），物质在两相间的分配是瞬间完成的。
● 物质在两相间的分配系数总是一个常数，与溶质浓度无关。
● 流动相不是连续地进入色谱柱，而是脉冲式进入色谱柱，即一个“塔板体积”的载气进入后，再进入另一个“塔板体积”。
● 设有一根色谱柱里面有5个理论塔板，也就是把色谱柱分成5小段，在每一小段里进行两相分配。
● 设一种物质在色谱柱内的分配系数是1(K=1)，满足以上假设成立的前提下，将100µmol物质注入色谱柱进行分离。
开始时，即m=100µmol物质全部加到第0号塔板上，分配平衡后，由于k=1,即ms=mm，所以ms=mm=50。当一个塔板体积的流动相进入0号板时，就将流动相中含有mm部分组分的流动相带入到1号板上，此时0号板固定相中ms部分组分及1号板流动相中的mm部分组分，将各自在两相间重新分配。故0号板上所含组分总量为50，其中液固两相各为25，而1号板上所含总量同样为50，液固相亦各为25。以后每当一个新的塔板体积流动相进入色谱柱时，上述过程就重复一次（详细的分配过程见下表）。
其中：tR是溶质保留时间，W为该溶质洗脱峰在基线处的宽度，W1/2为半峰宽。
理论塔板高度计算公式：
分离度R与柱效n、选择性α和容量因子k的关系如下：
从公式中可以看出，改善分离度的三个主要因素分别为：
第一项为柱效项，提高理论塔板数n，不仅分离度R改善，而且色谱峰变得尖锐，有利于提高检测灵敏度；
第二项为柱选择项，选择性系数α又称分配系数比，与离子在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关，α增大，该项的值也随之增大，分离度也增大；
第三项为容量因子项，k不仅随柱温、柱压变化而变化，还与流动相及固定相有关。k越大，说明固定相对此组分的容量越大，保留时间越长，不过k的增大将增大色谱峰的展宽，从而降低检测灵敏度。
1、通过谱图峰型判断，查看在标准条件下，常见离子是否有严重前伸和拖尾现象。可查看峰的不对称性。
离子色谱正常的色谱峰一般是呈对称的高斯峰，当使用或放置时间较长以及某些特殊原因会导致色谱图上的峰形会发生变化，有的表现为前沿峰，有的则是拖尾峰。
2、通过保留时间（tR）来判断，一般柱效下降时，离子的保留时间会缩短。
3、通过分离度判断，一般而言，分离度下降，可以显示柱效下降。
4、通过系统压力的变化判断，情况比较复杂，一般柱效下降时，柱压会有升高的现象；但如果是分析柱的功能材料流失，此时柱压下降，同时柱效也下降。
“塔板理论”以分配平衡为基础，导出色谱流出曲线方程；定量地说明了色谱柱的柱效以及决定色谱峰区域宽度的参数；同时，广泛应用理论塔板数或理论塔板高度作为色谱柱柱效评价指标。
“塔板理论”是在基于一定假设的基础上研究溶质的分配行为，这与实际情况是不完全相符合的，尤其是忽略了流动相流速对柱效产生的影响，所以不能解释为什么同一溶质在不同的流动相流速下，给出不同的理论塔板数；也不能深入的说明色谱柱内部结构参数、实验条件与理论塔板数之间的关系。
鉴于塔板理论的局限性，我们将从Van Deemter提出的速率理论来看固定相颗粒、流速和柱温对柱效及分离的影响，该理论对我们如何提高柱效、改善分离有了更确切的指导。
由于塔板理论在研究过程中是基于一些假设成立情况下得到的结论，因为色谱柱内并没有这些塔板，当同一组分进入同一色谱柱，流动相速度变化时，得到的是不同的色谱图，测得的n和H也不同，所以“塔板理论”属于半经验理论。
为了克服“塔板理论”的局限性，Van Deemter（范迪姆特）等人提出了色谱过程的动力学理论。此理论是建立在塔板高度这一概念基础上又考虑了动力学的影响因素，提出了“速率理论”。“速率理论”充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，更接近组分分配的实际情况。
当样品进入色谱柱到流出，谱带必然会展宽，那么造成谱带展宽的原因是什么呢？我们来看下Van Deemter方程与柱效的关系。
对于一个固定长度L的色谱柱，塔板高度H越大，柱效n越低。我们来具体看一下公式中A、B、C三项各与哪些因素有关，及如何减小各项的值来提高柱效。
当组分随着流动相流出色谱柱时，填料颗粒的阻力会作用于组分和流动相，从而不断改变其流动方向，致使即使同一组分中，不同的分子在通过填料的过程中所走的路径也不一样。最后流向统一目的地，路径最长和最短的时间相差越大，那么谱带展宽越严重。
λ：色谱柱中载体颗粒大小及分布、填充均匀情况相关的常数。
从公式来看，想要A值小可以减小dρ和λ，但是，dρ和λ之间又存在相互制约的关系，研究表明色谱柱填料颗粒较大时，越容易获得均匀密实的色谱柱(λ小)。所以，为了A值减小，那么dρ减小，同时也要考虑λ值，因而要求dp适当地减小。
下图为不同大小粒径的色谱柱在测定相同浓度标准品时的谱图，可看出小粒径的（5μm）的柱效更高，峰型更尖锐。
纵向扩散是组分（或离子）在进入色谱柱时发生的浓度变化。由于存在浓度梯度，所以样品在色谱柱入口处会随着流动相的推进，自发地扩散开来，引发谱带展宽。
下图为不同内径A Supp 16–250（4mm VS 2mm）在测定相同浓度标准品时的谱图，可看出2mm内径的灵敏度更高。小内径柱子降低纵向扩散效应。
通常传质阻力包含流动相和固定相间两部分阻力，由于传质阻力的存在，组分在两相间不可能瞬间达到平衡，从而引起谱带展宽。
“组分要从流动相转移到固定相中，必须从流动相主体扩散到液固界面，流动相传质阻力就是阻碍这一扩散进行的。组分从流动相扩散到两项间需要一定时间，而且不同分子（或离子）在两项界面的距离不同，所以到达的时间也不同，有的分子（或离子）前到达，有的后到达，这就导致了谱带展宽。而且受到色谱柱功能团影响，离填料越近，移动的越慢，从而也引起谱带展宽。
组分到达两项界面后将继续扩散到固定相内部达到分配平衡，然后再返回到两项界面。组分在这一过程中存在阻力，即为固定相传质阻力。
● 采用相对分子质量小作为载气，Dg大，Cg ∝1/ Dg
● Dl 越大越好，增加柱温度，但会使k值减小，为了保持适当的Cl值，应控制适宜的柱温。
1、组分（或离子）在色谱柱内内存在涡流扩散、纵向扩散及传质阻力，导致不能瞬间达到平衡，是造成谱带展的主要因素。
2、选择合适的填料粒径、流动相及流速可提高色谱柱柱效。
3、“速率理论”阐明了流速、柱温和色谱柱粒径对柱效及分离的影响，为色谱的分离提供了理论指导。
4、由于存在各种因素相互制约，选择合适的条件才能使柱效达到最高。例如：流动相的流速增大，纵向扩散影响减小，能够使柱效提高；但同时传质阻力项的影响也增大，又使柱效下降；柱温升高，有利于减小传质阻力，但又加剧了纵向扩散。因此，根据实际情况调整方法参数。
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