那么区分HPLC、UHPLC、UPLC的关键点就是分离性能。

1、技术原理不同 

（1）UPLC的原理：借助于HPLC（高效液相色谱）的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。

（2）HPLC的原理：以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。
2、特点不同

（1）与传统的HPLC相比，UPLC的速度、灵敏度及分离度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍，它缩短了分析时间，同时减少了溶剂用量降低了分析成本。不过由于实验过程中仪器内部压力过大，也会产生相对应的问题。例如泵的使用寿命会相对降低，仪器的连接部位老化速度加快，包括单向阀等部位零件容易出现问题等。
（2）而HPLC，流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压；分析速度快、载液流速快，较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时；分离效能高，可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍；灵敏度高，紫外检测器可达0.01ng，进样量在μL数量级；应用范围广，百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。

最主要的部分是色谱柱的粒径。

HPLC如最常见的C18柱（5um，4.6mm * 250mm）， 超高效液相色谱柱相对更小，如3.5um 3.0um，甚至更小，2.0um。由于粒径小，固定相的表面积变大。例如，一个5um的支柱就像一条充满石头的河流，一条2.0um的支柱是一条充满细沙的河流。通过这种方式，样品分离得更快，节省了大量的流动相和时间。但仪器上的压力会更高。
因此，超高效液相色谱（UHPC）的主要改进是提高其泵效率和组件耐压性。如果将小柱置于正常液相中，则确定柱压力将超过压力上限并且界面将泄漏。如果高效液相色谱（HPLC）充分利用这种小粒径色谱柱，则可以节省成本并获得更好的结果。

用文字总结为三大标准：

HPLC高效液相色谱：扩散体积>30μL，最高耐压<6,000 PSI的液相色谱系统，最适宜色谱柱粒径是5µm；

UHPLC超高效液相色谱：扩散体积15-30 µL，最高耐压≥9,000 PSI的液相色谱系统，最适宜色谱柱是粒径粒2-3.5μm的实心核颗粒色谱柱；

UPLC：扩散体积<15 µL，最高耐压≥15,000 PSI的液相色谱系统，最适宜色谱柱粒径是 <2µm。

至于上述各种类型色谱给用户带来的不同感受，大家可回顾和参考超高效液相色谱的好处：更高分离度、更高效率、更快速度、更省溶剂、更环保、更适合连接质谱等等。

1、溶液的制备很关键

在色谱系统中，溶液是一个更重要的部分，那么UPLC中溶液的制备应该是怎样的呢？

样品溶液的制备

样品的制备同样是过滤和离心两种方法。

过滤：根据样品溶液的极性，选择不同材质的0.22um滤膜过滤。

滤膜的选择，要进行分析方法确证，滤膜的相容性实验。

*此处强调一下，必须是0.22um，千万不要用错。

离心：采用高速离心的方式（大于10000转/分钟）。

离心的方法一般适用于过滤较困难的溶液，为了保护UPLC的系统，离心完毕后建议再次进行过滤。

流动相的制备

所用有机相应是进口的色谱级别。使用的水应为超纯水，MILLI-Q纯水机生产的即可。

配制缓冲盐溶液应该有效期的规定，根据各实验室SOP规定。

所有的流动相用前必须使用0.22um的微孔滤膜过滤。

有很多同仁在平衡色谱柱时，因为使用的是甲醇/水或是乙腈/水系统，因为不涉及到缓冲盐溶液，经常把过滤这一步省略，再次提醒大家：

UPLC系统使用的所有流动相均必须经过0.22um的微孔滤膜过滤。

2、色谱柱的使用

若柱效不佳，将会浪费样品分析时间，问题排查时间，更是浪费宝贵样品。所以色谱柱的使用操作的规范性，直接决定UPLC的分析效率与数据可靠性。

首先，应与色谱柱的供应商沟通，充分了解色谱柱的性能，如反相柱、正相柱、氰基柱、亲水柱、离子交换柱等。

再次，建立色谱柱的管理SOP，在SOP中规定色谱柱的登记、启用、使用及报废记录，便于色谱柱整个生命周期的管理。

色谱柱的启用

色谱柱包装开启后一定要阅读说明书，关注说明书中的注意事项，如pH的适用范围、流动相中能否采用水、平衡时的流速，保留溶剂等。

对于正相色谱柱来说，最重点的时注意初始流速一定要小，一般0.2ml/min。

反相柱就比较麻烦一点了，先用小流速0.2ml/min的甲醇冲洗2小时，再用10%甲醇冲洗2小时，最后过渡到检品的流动相，流速由低逐步增加到目标流速。

柱子开始使用前，必须确认系统适用性测试是否满足要求，主要关注理论板数、分离度、拖尾因子等关键分离参数，验收合格后才能使用。

色谱柱的清洗和保存

正相色谱柱进样后一般无需刻意清洗，但是需要保存时，必须按照说明书要求选择溶剂，以免长时间引起固定相干涸。反相色谱柱清洗过程：高水相等度洗脱保证缓冲盐冲洗干净后，梯度洗脱的方式过渡到纯有机相，等度洗脱10~30柱体积，柱温可适当提高2~5度，方法运行完及时关闭柱温。

对于亲水作用色谱柱：最后保存尽量避免使用纯有机相，应包含少量的水，比如95%的乙腈。       

色谱柱的使用

使用色谱柱，应轻拿轻放，安装零死体积。

切忌由大流速变化引起的压力变化对色谱柱造成机械损伤，应使用逐渐提高流速的方法达到目标流速。

建立色谱柱的使用记录，记录中体现出理论板数、分离度拖尾因子、柱压、保留时间、流动相体系、保存溶剂等信息，一旦发现参数异常，以便展开调查，避免偏差发生。

色谱柱使用过程中，应关注其柱压、柱效，使用完毕后填写“色谱使用记录”。

色谱柱最好是专用，带保护柱。并且使用过缓冲盐的色谱柱最好不要用于新项目的方法开发。

低紫外区的检测，为了避免“鬼峰”的出现，可以使用捕集柱，色谱柱使用完毕后一定要按SOP及时清洗。

对于鬼峰捕集柱的使用，很多科研单位觉得不可行，不知道如何在标准中进行表达。其实在方法建立过程中，如果鬼峰无法避免，可以在“发展报告”中说明使用鬼峰捕集柱的理由，并在标准中如实描述，以便与厂家或是QC进行方法转移。

有关亲水性色谱柱，小编也有些提议：

以HILIK色谱柱为例，使用更少或是较弱的极性溶剂可以增加极性化合物的保留。

样品溶解的溶液尽可能接近流动相条件的初始条件，然而，极性大的分析物经常在有机溶液中存在溶解度较低的现象，可以先用水溶解样品，再用乙腈/水溶液进行稀释，需要平衡溶解度和峰形之间的关系，根据化合物性质，具体情况具体分析。

色谱柱的报废要素

1.色谱柱堵塞，压力升高1000psi。

2.色谱柱污染出现鬼峰、噪音增加、检测限增大时。

3.填料塌陷或污染引起色谱图前沿、拖尾、分叉时。

4.理论板数、分离度、拖尾因子按各检品质量标准规定执行，未规定的按各国药典通则规定执行，不符合上述规定时。