误解1：无法反转HPLC色谱柱

假。实际上，高效液相色谱（HPLC）色谱柱的填充压力要比其最大操作压力高得多（通常是其两倍）。因此，如果使用适当的溶剂并分配了稳定填充床所需的时间，则填充良好的色谱柱应该能够在两个方向上工作。人们可能想使色谱柱沿相反方向流动的一些原因包括：在色谱柱切换中进行反吹操作，用顽固强力吸附的样品冲洗色谱柱的入口。冲洗捕获的颗粒以减少压力积聚。

反相HPLC色谱柱的流程有一个例外。如果制造商在色谱柱入口处使用了较高孔隙率的玻璃料，则可以通过反转色谱柱将颗粒从填充床中冲洗掉。在工厂包装色谱柱时，在色谱柱出口处的熔块孔隙率必须低于色谱柱的最小粒径。例如，如果色谱柱填料的平均直径为5μm，粒径分布为3–7μm，则色谱柱出口处使用的玻璃料必须小于3μm，这样就不可能有颗粒逸出填料使用色谱柱时要铺床。例如，大多数制造商选择2μm的玻璃料。

制造商为何在色谱柱的入口和出口处有不同的孔隙度？简单。较高孔隙度的玻璃料比较低孔隙度的玻璃料具有更少的堵塞趋势。0.5μm的玻璃料比2μm的玻璃料堵塞更快。因此，为防止压力迅速增加和客户抱怨，制造商可能在入口处使用宽容度更大的多孔玻璃料。通常，该列将用箭头标记，指示仅应在一个方向上使用它。反转HPLC色谱柱之前，最好查阅色谱柱说明书或与色谱柱制造商联系，以查看色谱柱是否可以反转。

误解2：所有C18（L1）列都相同

假。在HPLC的早期，十八烷基硅烷（最常被称为ODS或C18相）是最早可用于称为“反相色谱”的新技术的键合固定相之一。它成为了反相色谱的标准相，并被大多数从业者迅速采用。由于制药业是HPLC的较早采用者，并且监管机构不想加持特定制造商的色谱柱品牌，因此，美国食品药品管理局（FDA）和美国药典（USP）开发了一种分类系统，该分类系统为在新药申请下提交的每种新方法。对于HPLC色谱柱，给定了“ L”标记，并且由于大多数提交物中都使用了C18，因此它变为“ L1”。随着添加附加相，它们被赋予了自己的“ L”编号（例如，L7 C8，L10 CN，L11苯基等）。

不幸的是，该指定系统被证明是不可靠的，因为使用硅胶作为基础材料，每个商业C18色谱柱的合成方法都不相同，并且所得反相色谱柱具有不同的性能。例如，一些制造商使用十八烷基一氯硅烷和低表面积硅胶（图1），而其他制造商使用相同的硅烷，但将其粘合到更大表面积的硅胶上。这两个C18色谱柱的行为会有所不同，后者的C18相比前者更多。较低覆盖率的键合相有时含有未反应的硅烷醇，从而导致混合的保留机理。一些制造商使用二氯硅烷和三氯硅烷，并使键合相聚合形成具有不同扩散特性的较厚层。为了减少在键合过程后残留的未反应的硅烷醇，一些制造商使用少量的硅烷（例如三甲基一氯硅烷）封端了这些硅烷醇。硅烷醇有时负责碱性化合物在中等pH值下的拖尾作用。一些制造商使用聚合物基材料，然后将C18部分结合到其表面上，从而形成完全不同的C18包装材料，但仍被认为是“ L1”。其他人则使用表现出不同程度的反应性的有机烷氧基硅烷，并且可以产生与有机氯硅烷试剂相比稍有不同的C18键合相。

因此，即使今天，“ C18不是C18也不是C18”这一说法仍然成立。所有C18相都不相同，用户应确保开发出一种方法后，并坚持使用相同的色谱柱部件号，以确保方法坚固耐用。

误解三：保护柱不影响分离

假。首先，有一个保护柱是个好主意。但是，如果选择了错误的配置或相位，保护柱的选择会对分离产生很大影响。请记住，保护柱的目的是保护分析柱免受高度保留的样品组分，微粒和其他不良物质的污染。保护柱比它保护的分析柱便宜得多。因此，它可以更频繁地更换，而不是更昂贵的分析柱。

理想情况下，选择的保护柱应具有与分析柱完全相同的固定相。如果该相更具保留性（例如，具有更大的碳载量或为混合模式相），则它可能通过引起保留时间偏移甚至选择性差异而以有害的方式影响分离。如果该相的保持力较弱，则可能会或可能不会引起问题，除非所选的相影响了整体选择性。

为了使保护柱对分离性能的影响最小，必须将保护柱正确地插入流路中。显然，保护柱插入在进样器和分析柱之间，但是如果使用过多的连接管（过长或两个内径较大），则会发生柱外带扩展，从而影响整体分离。采用集成保护柱的系统会提供最佳解决方案，其中保护柱实际上与分析柱对接。但是，集成式保护柱通常与盒式色谱柱系统相关联，这似乎已受到人们的青睐。无论采用哪种配置，保护柱都应能够轻松卸下并从HPLC系统中更换，而不会影响其操作。

从理论上讲，如果保护柱在分析柱上增加了额外的柱长，则应该产生额外的塔板，从而增加色谱分离度。但是，由于前面讨论的一些因素，通常添加保护柱只会使分离效果保持最佳状态，有时甚至会降低分离效果。保护柱的优点是延长了色谱柱的使用寿命，并不一定增加总效率。

误解四：高温总是导致更好的分离

假。随着温度升高，流动相的粘度降低，因此，溶质传质的速率应增加，从而提供更好的色谱效率。的确如此，但是除了色谱柱效率项（H）之外，温度还会影响保留因子（k）和选择性（α）。对这些术语的影响会导致分辨率提高（这是色谱分析中我们真正关心的问题）或有损分辨率。保留时间通常随温度升高而降低，因为作为热力学参数，分析物更喜欢保留在流动相中，并从色谱柱中更快地洗脱出来。但是，不同的化学物种其保留度随温度变化的程度可能不同。更正确地说，它们的范霍夫图（ln k vs 1 / T，其中温度T以开尔文为单位）可能显示不同的斜率。换句话说，它们的α值可以改变。另外，高温会导致低k峰被迅速洗脱，以至于它可以在t0或接近t0时洗脱，即未保留的峰保留时间，因此难以量化。

以图2为例，该系列色谱图显示了在20–90°C的柱温下七种止痛药的分离。可以注意到色谱图的几个特征。首先，随着温度的升高，所有峰的保留降低，并且峰的确变窄，表明效率提高。其次，相对于最接近的洗脱化合物峰5和6，一种止痛化合物水杨酸随温度的保留变化更大。实际上，将温度从20°C升高到40°C后，洗脱顺序颠倒了。在30°C的中间温度下，水杨酸和峰号6，非那西丁被共洗脱。因此，在这种情况下，高于40°C的温度会使整个分离过程的分离时间缩短，但洗脱顺序却从较低的温度开始发生变化。

当然，在较高温度下操作的另一个好处是降低了色谱柱的工作压力，使操作人员可以使用更高的流速或更小的颗粒。

在较高温度下可能引起色谱柱性能问题的另一个实验参数是进入的流动相可能存在的热失配。例如，如果将色谱柱加热到60°C且进样的溶剂处于室温，则进样的较冷的溶剂会导致峰变形，因为溶质在色谱柱的初始部分可能会经历温度差异。当使用更高的色谱柱温度时，建议对流动相进行预热。

误解5：碳载量越高，反相塔越好

假。对于流行的烷基键合相，似乎对链长，碳载量，表面覆盖率等的作用存在误解。通常，对于真正的反相机理，其中保留是基于分析物分子的相对疏水性，保留通常是基于碳载量。碳负荷越高，保留率越高。碳负荷可以与链长成正比，但不一定如此。典型的硅胶具有约8.0μmol/ m2的反应性硅烷醇，用于键合有机硅烷试剂。例如，如果对于单层键合相的给定表面覆盖率（以微摩尔每平方米为单位），链长越长，碳原子就越多，因此保留率将与链长成正比。但是，如果较短的链键合相（例如C8）具有较高的表面覆盖率，从而导致表面上有更多的碳，则与C18键合相相比，它可能具有更多的保留。另外，一些制造商使用二氯和三氯有机硅烷，其中使用聚合来增加相覆盖率。可以想象，较短链长的聚合物相比较长链单体的相具有更大的覆盖率。有时，这些聚合物相的键合相层较厚，与单体相相比，固定相的质量传递较差。

负载量很大的反相色谱柱也容易发生相塌陷或更准确地说是固定相去湿。3对于此类色谱柱，当有机改性剂的量在水性环境中降至10％以下时，这些“油状”疏水相往往会倾向于自缔合而不是处于极性水溶液中（也就是说，喜欢喜欢）。因此，在这种情况下，高碳载量可能不利于成功的反相色谱分析和可再现的保留时间。

误解6：使用填充较小颗粒的色谱柱，总能获得更高的效率

假。尽管对于填充良好的色谱柱，随着填充色谱柱中颗粒平均直径的减小，效率会提高，但如果柱外对特定HPLC硬件系统的谱带扩宽的贡献足够高，则该色谱柱的全部性能将无法获得被实现。柱外成分包括填料本身以外的所有其他体积。这些贡献包括以下内容：

进样量包括回路尺寸以及进样阀内的其他体积。

从进样器出口到色谱柱入口的油管容积。

保护柱间隙的体积，包括端接头（如果有）。

在线过滤器体积（如果有）。

入口色谱柱接头内的内部容积包括多孔熔块和流动通道。

间隙列的体积。

底部色谱柱接头内的内部容积包括多孔玻璃料和流动通道。

从色谱柱出口到检测器入口的油管容积。

流通池之前的检测器内的管道容积。

流通池体积。

所有这些体积的方差都是累加的。因此，可以最大程度地减少进样量并使色谱柱入口管的长度短，内径小，但如果从色谱柱出口到检测器的连接管有1 m的0.20英寸，则谱带展宽可能足够大影响分离的整体效率。因此，如果您希望获得亚2μmHPLC色谱柱或内径为1.0 mm的色谱柱的预期效率，请确保将柱外效应降至最低。

误解7：对于硅胶填料，残留的硅烷醇导致拖尾峰

假。在某些情况下，存在于所有基于硅胶的键合相色谱柱上的硅烷醇会引起拖尾，特别是对于碱性化合物而言。这种拖尾归因于硅烷醇基团是一种弱酸，pKa约为4.5-4.7。因此，当流动相的pH值接近4-5时，硅烷醇被离子化，并可以通过静电吸引作用与带正电的分子（如质子化的胺）相互作用。通过将pH值降至3以下来抑制硅烷醇的离子化，可以最大程度地减少这种相互作用。对于某些碱性化合物，有时在较低的pH值下会出现拖尾现象。有专门设计的反相填料，可以为碱性化合物提供良好的峰形。

峰拖尾的三个基本原因：化学问题（其中一个已在前面讨论过）；色谱柱填充问题；和仪器硬件问题。所有这三个因素都可能导致峰拖尾，并且一个必须调查根本原因以确定补救措施。详细讨论所有这三个问题不在此问题的范围内，但是每种类型的一些示例将为您提供总体思路。首先，除了与硅烷醇的相互作用外，与化学有关的拖尾问题还可以通过几种方式表现出来。金属螯合化合物可与色谱柱填充物中的微量金属发生相互作用，这对于较旧的二氧化硅材料尤为明显。使用错误的注射溶剂有时会导致拖尾。用比流动相强得多的溶剂注入样品会产生峰形失真。尾矿可能是由于色谱柱顶部强烈保留的样品组分或流动相杂质造成的堆积材料引起的。这种材料可以充当不同的固定相，从而导致相互作用的化合物出现拖尾问题。有时会出现混合模式，从而导致拖尾。在这里，溶质可以通过反相和离子相互作用与活性基团相互作用。有时，当流动相的pH值错误并且样品被部分电离时，所产生的峰可能会失真并且类似于拖尾。较大峰背面的部分共溶峰较小，有时看起来像拖尾。

色谱柱填充问题可能导致峰拖尾。色谱柱顶部的空隙会导致双峰或峰拖尾。填料不充分的色谱柱可能会形成通道，导致峰形变差。如果色谱柱因样品质量过大而超载，则可能会出现拖尾现象，尽管峰前沿更为普遍。在低进样质量下，硅烷醇超载可能发生拖尾。

让我们考虑一些可能会拖尾的仪器和硬件问题。尾矿可能是由柱外效应和流路中其他未清扫的体积引起的。末端接头或连接不正确造成的未清除体积可能会显示为峰拖尾。来自进样器的压力脉冲可能会导致色谱柱空隙，从而导致拖尾。缓慢的检测器时间常数和快速洗脱的峰会导致峰展宽，有时类似于拖尾。在室温下进入的溶剂与较高的色谱柱操作温度之间的热不匹配也会导致峰变形。

因此，并非总是硅烷醇在HPLC中引起峰拖尾。

误解8：硅胶填料只能在pH 2至7范围内使用

假。通常，HPLC反相色谱柱的化学降解机理有两种：pH值小于2时硅氧烷键的催化水解；液相色谱法。pH值大于7-8的氢氧根离子可溶解硅胶。这两种现象已由Kirkland及其同事进行了广泛研究。5-7在pH值小于2时，–Si-O-Si-（硅氧烷）键可被氢键（H3O +）裂解键合相攻击，从而导致在有机的损失。随着时间的流逝，保留率通常会随着碳含量的降低而降低。对于短链封端部分，例如三甲基硅烷，尤其值得注意。较长的C18相由于其空间位阻而对下面的硅氧烷提供了一定的保护，但最终甚至会受到侵蚀，尤其是在温度高于环境温度的情况下。有空间保护和紧密覆盖的键合相，可帮助阻止键合相在硅胶上的裂解。聚合物相没有显示出这种不稳定性，但是具有比基于二氧化硅的相效率低的缺点。

在高pH值方面，必须有某种方法来阻止下面的硅胶受到氢氧根离子的侵蚀。一旦发生溶解过程，色谱柱最终将失效，经常会形成空隙。特殊色谱柱专为高pH操作而设计，包括二齿C18，杂化和聚合物涂层二氧化硅。这些相从化学上保护基础材料免受氢氧化物的侵蚀。这些填料能够承受11–12范围内的pH值。在此范围内操作时，大多数二氧化硅基填料应避免高温。当然，聚合物相可以在高达13的pH值下操作，有时甚至达到14，但是，如前所述，它们的缺点是效率低于二氧化硅基相。

因此，真正的答案是：特殊的硅胶键合相可以在pH值为2–7的窗口之外操作，但应注意使用常规的硅胶填料，尤其是在高温下。

误解9：现代HPLC色谱柱应承受至少1000次进样

假。有许多因素可控制任何现代HPLC色谱柱可以承受的进样次数。一些因素基于模式：反相，离子交换，尺寸排阻，正相，手性，亲水性相互作用等。其中一些因素取决于色谱柱中填料的类型，例如硅胶填料，杂化填料，氧化锆填料或聚合物填料，或软凝胶或树脂的交联度。一些因素取决于相本身：覆盖范围，键的类型，聚合物相，单层或涂层相。其他因素取决于操作条件：pH，温度，流动相成分，缓冲液组成，流速，压力等。其他因素还取决于所注入的样品：仅标准样品，样品清洁度，样品pH值，样品体积，样品中存在的杂质，溶质分子本身等。

如果滥用色谱柱，例如在超出其建议的pH限制或流速范围内使用色谱柱，则可能只会进样50次甚至更少。如果样品简单，没有高度保留的杂质，则色谱柱可承受5000次或更多次进样。如果色谱柱未在其上限处连续运行，则使用寿命会更长。如果色谱柱受到各种样品的影响，并且从未冲洗过以去除强烈保留的杂质，那么它将缩短其寿命。

大多数人期望当5μm反相色谱柱用于分析配方，简单药物混合物和标准品时，至少要进样1000次。如果该色谱柱用于“脏样品”，例如尚未彻底清除的生物液体提取物或环境提取物，则不应期望进行1000次进样。

因此，预期的进样次数不是切割和干燥的，而是高度取决于色谱柱的类型，操作条件，样品清洁度和滥用程度。当然，对于保护柱和也许在线过滤器，色谱柱寿命应更长。在作者多次研讨会期间对观众进行的非正式民意测验中，一小部分用户（少于15％）实际上跟踪给定列的注入次数。因此，许多色谱分析人员实际上并不知道每根色谱柱的使用寿命可获得多少次进样。一些现代的HPLC仪器具有内置的色谱柱模块和软件，可以使它们监测进样次数。

误解10：色谱柱应始终盖紧，以防止填料与大气接触而损坏

假。通常，端接件上的小孔的直径可能不大于0.02英寸，其横截面面积很小，以至于空气进入填料和溶剂内部的溶剂接触会损坏色谱柱。色谱柱蒸发极少。即使有少量空气进入色谱柱，也可能很难扩散通过微粒填充床并与足够的填充材料接触，从而产生不利影响。如果色谱柱中有少量空气，则在下次将其安装到HPLC仪器中并对其进行泵送流动相后立即对其加压，则少量的空气可能会在高压下溶解或被冲洗掉。初始液体在短时间内不会对以后的使用造成任何问题。但是，如果一定要通过封住端接装置而感到更加安全，那就这样做。大多数色谱柱配备了阳压缩接头盖，可以拧紧这些螺帽，以防止存储溶剂蒸发或空气进入填充床的任何可能性。