【解惑】以工程师的角度告诉你荧光检测器的那些维护知识

赵桂芝 0 2023-12-05

点赞 0 收藏

分享到

荧光检测器液相氙灯

荧光检测器，它是一种化学发光检测，是指激发态分子从激发态回到基态时发光的现象，当激发能是光时，这个过程叫做光致化学发光。今天小析姐就带你用工程师的角度来看那些荧光检测器的小问题。

荧光检测器，它是一种化学发光检测，是指激发态分子从激发态回到基态时发光的现象，当激发能是光时，这个过程叫做光致化学发光。

一、基础概念

当分子吸收一定波长的光从基态转换到激发态，激发态分子转换回到基态，并伴有光辐射出现，如果分子被照射之后发光时间为 10-9 秒到 10-5 秒，这一过程叫做荧光，也就是光灭的比较快。

如果分子被照射之后发光时间大于 10-3 秒，这一过程叫做磷光，也就是光灭的比较慢。

这张图展现了荧光检测器光学系统的所有元件，这些元件都装在检测器室中的一个金属盒子里，您打开这个盒子的机会应该不多，最好没事别打开，容易进灰。

首先看一下光源，光源是一个氙灯，此灯以 3 µs 的闪烁频率发出 200 nm 到 900 nm 的连续光谱，如果您打开仪器的上盖，一定小心这个灯特别的烫，即使工作了几分钟也会非常烫。

光栅利用三相无刷直流电机转动，它决定了光落到流通池上的波长范围，光栅表面有许多微小的凹槽，每毫米有 1200 个凹槽，千万不要用手直接接触。

流通池是由固体熔融石英体做成，可承受最大 20 bar 的背压，这个石英的流通池非常脆弱，所以一定后面不要连检测器，也不要用大流速或粘度高的流动相冲洗它。

在流通池后面有一个参比二极管，来测量穿过流通池的激发光，并校正闪光灯的波动和强度造成的漂移。

这个动画我们来研究一下荧光检测器的光路，首先是氙灯发光，在图中以红色表示，这时光有很宽的带宽，到达激发光栅之后，光栅的位置决定了激发光的波长，被选择波长之后的激发光以蓝色表示，照射流通池。

透过流通池的激发光到达了参比二极管，流通池的样品被激发光照射后产生荧光。

荧光用紫色表示，因为荧光波长和激发光的波长是不一样的，在这里用蓝色和紫色进行区分，经过发射光栅，选择特定波长的发射光通向光电倍增管，产生信号，发射光栅选择的光用绿色表示，代表与前面的光不同。

之前紫外节目我们探讨过，紫外可以形成时间、强度、波长三维的图像，荧光当然也有，这张图是通过将样品注射到流通池中对样品进行扫描，形成激发波长、发射波长和强度的三维图。

这里我们可以清晰的判断出最大的发射波长是440 nm，这个化合物特征波长是250 nm、315 nm 或 350 nm，这是一种非常直观方便的判断最佳激发和发射波长的方法，不过要找纯品注射到检测器还是有点麻烦。

另一种优化化合物激发和发射波长的方法，就是一个样品运行两次荧光，分别对每个物质的激发波长和发射波长进行优化，将两者结合就可以得出最优的检测条件，不需要拧管线，不需要配置双检测器，仅仅跑两针样品就能搞定。

还有一种方法是需要DAD和荧光检测器串联使用，一次就可以优化一系列化合物的激发和发射波长，因为对多数有机化合物来说，使用二极管阵列检测器得到的紫外光谱，和荧光激发光谱几乎完全一样。如图中蓝色线和黑色线，从二极管阵列检测器可以得到紫外和激发光谱，荧光检测器可以采集发射光谱。

这里就涉及到一个问题，既然DAD和荧光激发光谱几乎一模一样，也就是这个化合物有紫外吸收，为什么还需要荧光检测器呢，直接用紫外不就好了。

个人感觉荧光的特异性更强，毕竟比紫外多了一维的信息，紫外只有波长进行选择，而荧光有激发和发射两个维度，这样受到干扰的可能性就更小，而且荧光的灵敏度非常高。

荧光检测器多用于检测能激发荧光的化合物，它的特点是灵敏度高，选择性好，多用于环境，食品等领域中痕量物质的检测。荧光检测器使用的光源为氙灯，氙灯能量高，且选择性低，但寿命较紫外灯稍短。

二、氙灯的安装

⑴切断电源

⑵拆卸掉标记的5个螺丝，卸下光源外盖。

⑶戴上安全眼镜。

⑷取下连接灯罩与主机的插口，拧松灯罩固定螺丝。

⑸抓住灯罩拉手，将拉手侧轻轻往上提起来，并从主机中将灯罩拉出来。

注意：

关掉电源后，如之前灯是开启状态，一定要等5分钟再去拆卸螺丝，以免烫伤。
不要用暴力拉灯罩，灯罩下有滚轮，稍微用力即可拉出。

（6）装入氙灯

每个氙灯上下都会有“＋”或“－”标识，代表阳极和阴极。氙灯如下图所示，先将等上下两个螺母取下，后将灯按灯罩阴极连接灯阴极，灯罩阳极连接灯的顺序，进行连接，并保证图中灯突起部分对着仪器前面板。灯安装好后，再将灯罩装进本体。

（7）灯罩装回本体

顺着滑轨，在提起灯罩的状态下，插进仪器内部后，向下压进去。如果设置正确，灯罩不会晃动；然后用固定螺钉固定灯罩，将接头接在仪器上。装好灯罩后，关闭光源盖板，接通电源（确认灯泡的亮灯状况）。

注意：

以上操作时，一定要佩戴无粉手套，防止在灯上留下污迹。
一定不要正负极接反，否则容易造成不可控的损失。
接通电源后，会有机械转动的卡卡声，属于正常现象，不要慌张。
一定要盖上所有盖板后，再开启电源。

调整氙灯的位置

氙灯装回后，需要稍微调整下灯位置，以保证可以获得最大能量。

图中所示，仪器右侧面的3根调整螺丝是用来进行灯位置的调整。

HORIZONTAL:水平方向的位置调整用螺丝。

FOCUS:光源焦点的位置调整用螺丝

VERTICAL:垂直方向的位置调整用螺丝。

(a) 粗调

打开维护软件中荧光检测器选项卡，将激发光波长(Ex)设定为550nm，发射波长(Em)设定为350 nm，取出流通池，边观察光像边进行调整。在试样室的激发光出口侧放张纸(激发光出口中央)，并观察激发光束的状态。将以VERTICAL、 HORIZONTAL、FOCUS的顺序一点点地反复转动。调整为激光光束(彩虹色)变成最亮为止。由此，完成光源位置的粗调。

(b) 微调

粗调完成后，将激发光波长(Ex)设定为350nm，边看数据边进行微调。按如下进行操作

①完成粗调后，请安装流通池。

②在维修软件中打开荧光检测器选项卡，激发波长(Ex)设定为350nm，发射波长(Ex)设定为350nm，在此状态下，边看画面的能量值(Ex)，以FOCUS，HORIZON， VERTICAL的顺序一点点地反复转动，直到显示值变成最大为止，显示值成为最大值时即可结束灯位置的调整，要求调整后能量数值在15000以上。

责任编辑：展源

审　　核：何发