开发化妆品中添加剂的检测方法，能够为化妆品的质量安全提供保障。本文介绍液质联用技术在化妆品添加剂研究方面的三个应用案例。

案例一

激素类添加物

皮质类固醇是一种广泛用于治疗炎症性疾病的有效药物。在皮肤病学中，它们可以缓解炎症性皮肤问题的症状，如牛皮癣和湿疹。含有类固醇的制剂(戊酸倍他米松、二丙酸倍他米松、曲安奈德等)通常以乳膏、凝胶和软膏的形式使用; 其他类固醇(氟尼索内、氟替卡松、布地奈德)以吸入溶液给药。通过口服给药的类固醇(强的松、强的松龙、甲基强的松龙)可用于治疗肝炎、系统性红斑狼疮、炎症性肠病。

皮质类固醇如在没有医疗控制的情况下使用会有严重的潜在副作用，如永久性皮肤萎缩和脓疱性牛皮癣。此外，还有高血压、糖尿病、骨质疏松、过敏性接触性皮炎等系统性副作用。尽管化妆品中禁止使用皮质类固醇，但市场上仍然存在假冒产品，对健康构成危害。

本研究目的是建立并验证一种液质联用方法，用于同时测定六种皮质类固醇，如戊酸倍他米松(BM 17-V)、倍氯米松(BC)、二丙酸倍氯米松(BCDP)、甲基强的松龙(MP)、布地奈德(BD)、氟尼缩松 (FN) (化学结构如图1-1所示)，用于假冒化妆品和天然产品的筛选。这六种皮质类固醇都属于糖皮质激素类，它们都是基于皮质醇的结构。选择这几种糖皮质激素是因为它们在药品中的广泛应用，特别是它们最常见于外用制剂(BM 17-V, BC)、片剂(MP)或溶液(BCDP, FN, BD)中。本研究^[1]建立了同时测定6种甾体激素(BM 17-V、BC、BCDP、MP、BD、FN)的LC-MS方法，通过对6种不同剂型作为复杂基质进行分析，验证了其线性、准确度、精密度和灵敏度。然后将该方法应用于市场上的11种化妆品的检测，这些化妆品疑似含有抗炎皮质类固醇。

考虑到所检测的类固醇的结构相似性(化学结构如图1-1所示)，梯度洗脱对于获得所有分析物是必不可少的。图1-2显示了标准混合物和具有代表性的加入标准品的化妆品(乳霜B)的总离子流色谱图。市场上可以买到含有上述皮质类固醇之一的商业制剂和假冒化妆品。每种产品的描述如表1-1所示。

表1-1  商业产品的描述。

图1-1 类固醇的化学结构

 

图1-2  类固醇混合标准溶液(A)和加入6种类固醇的乳膏B (B)的LC-MS TIC色谱图。类固醇浓度为5 ug/mL。

在优化的色谱条件下，采用常规的C18色谱柱，分离了戊酸倍他米松的异构体(BM 17-V和BM 21-V) (图1-3)，通过与标准品比较保留时间和串联质谱数据(图1-4)鉴定了所有被分析的皮质类固醇和两种BMV异构体。

 

图1-3  乳霜A的SIM色谱图(477 m/z)发现含有假冒皮质类固醇戊酸倍他米松，是两种异构体BM 17-V和BM 21-V的混合物。

 

图1-4  BM 17-V (a)和BM 21-V (b)的二级质谱图

本研究建立了一种基于LC-ESI-MS的准确、重复性好的方法，用于假药制剂中6种糖皮质激素(BM 17-V、BC、BCDP、MP、BD、FN)的含量测定。优化后的色谱方法能够分离乳膏、粉剂、溶液和片剂等复杂基质中的6种皮质类固醇。被分析物是通过MS/MS检测进行鉴定的，SIM模式用于定量。这是首次使用一种有效的方法同时测定化妆品中糖皮质激素的混合物。该方法适用于粉末、乳剂、溶液等有代表性的化妆品剂型，使用这种方法可以检测化妆品中是否存在常见的类固醇，可用于药品配方的质量控制和化妆品中疑似含有类固醇的假冒化妆品的筛选。

案例二

药物添加剂

近年来，市场上发现了许多新型的化妆品非法添加剂，新添加物多为新药或与其他禁用添加物结构非常相似的类似物，仅用液相色谱-质谱法(LC-MS)难以鉴定。为此，本研究提出了一种色谱分离与核磁共振结构鉴定相结合的新方法。

比马前列素bimatoprost和拉坦前列素latanoprost是治疗青光眼和高眼压(OHT)疾病的一线药物，其副作用包括睫毛多毛。不正确的使用可能会引起眼睛瘙痒、结膜充血、皮肤色素沉着和眼睛刺激。

本研究^[2]在睫毛精华液中检出了两种新物质，它们属于标签外物质，且不是现有的禁用添加剂，其结构难以确定。利用化妆品风险物质筛选平台，采用UHPLC-QTOF-MS /MS对化妆品样品进行筛选。与未添加非法添加剂的化妆品空白样品(图2-1中的“空白”) 的总离子色谱(TIC)对比，发现空白样品的总离子流色谱中不存在这两个峰。参考化妆品包装成分表中的化合物，这两个峰的信息表明它们不是制造商公开声称的添加剂。因此，这两个保留时间分别为9.64和4.84 min的峰值得怀疑。两种目标化合物的一级和二级质谱如图2-2所示。

 

图2-1  空白样品、样品1和样品2的总离子流图

利用UNIFI筛选平台对MS数据进行处理和分析，对采集到的数据自动进行离子流提取，并通过其元素组成预测未知物的分子式。得到化合物1的精确匹配分子质量为432.28757，化合物2的精确匹配分子质量为415.27226，通过软件推测其分子式分别为C₂₆H₃₇NO₆和C₂₅H₃₇NO₄。

通过制备高效液相色谱法纯化组分1和2，分别得到化合物1 (1.09 mg, t_R = 16.8 min)和2 (27.02 mg, t_R = 15.5 min)。通过NMR鉴定目标组分结构分别为拉坦前列素latanoprost和比马前列素bimatoprost，结构如图2-3所示。

 

图2-2  化合物1 (A1, A2)和2 (B1, B2)的一级和二级质谱

图2-3   前列腺素类似物(拉坦前列素latanoprost和比马前列素bimatoprost的化学结构

本研究建立了一种新的色谱分离与核磁共振结构鉴定相结合的方法，用于检测化妆品中未知或可疑的添加剂。本研究鉴定出睫毛液中的可疑物质为比马前列素和拉坦前列素，是市场中新发现的化妆品中的非法添加剂。这种策略有可能成为监管未知的化妆品添加剂的非常合适的手段，以确保化妆品的质量合规性和消费者的安全。

案例三

多种违禁添加剂

化妆品中禁用物质种类繁多，很难实现快速、全面的检测。大多数化妆品中禁用物质的分析方法只涵盖一类或两类化学品。目前，液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)广泛应用于化妆品中禁用物质的筛选，传统的一维液相色谱(1D-LC)在分析复杂样品中的多类分析物时存在明显的局限性。二维液相色谱(2D-LC)连接两种不同分离机制的液相色谱系统可以提高分辨率和峰容量。

本研究^[3]开发了一种基于稀释调制的2D-LC-MS方法，用于同时检测化妆品中的多类违禁物质。该2D-LC系统结合了HILIC和RPLC技术。建立的2D-LC-MS方法减少了分析物的共洗脱，通过稀释调制解决了流动相不相容的问题。最终，通过对化妆品中126种禁用化学物质的检测，验证了2D-LC-MS方法的可行性。

研究中比较了有稀释调制和没有稀释调制的二维RPLC的色谱图，图3-1显示了20个目标化合物的峰，结果表明，如果直接转移样品环中的组分而不进行稀释调制，则所有目标化合物在RPLC柱上的保留都很差(图3-1b)。相反，当使用高比例的弱溶剂(90% MPA2：0.1%甲酸)进行稀释调制时，来自一维HILIC的组分在混合器2中得到充分稀释。因此，目标化合物会在二维RPLC柱上得到很好的保留，峰形清晰对称(图3-1a)。结果表明，稀释调制成功地解决了2D-LC方法中流动相不相容的问题。

图3-1  在建立的2D-LC方法中，有稀释调制(A)和无稀释调制(B)的二维RPLC的色谱图。(A)中的稀释调制用90%的MPA2进行。

 

图3-2  通过HILIC法(A)、RPLC法(B)和2D-LC法(C)得到126个标准品的典型色谱图。

如图3-2所示，由于两种色谱技术的高度正交性，不同极性的化合物被不同的色谱柱保留以实现互补。第一次阀开关在HILIC柱死时间(2.1分钟)附近进行，此时，不能在HILIC上保留的物质被洗脱并收集到500 μL样品环中。局部麻醉剂、肾上腺素能药物、抗组胺药和其他中高极性化合物被HILIC保留和分离(图3-2a)，这些几乎是极性有机胺，在RPLC方法中分离受限。在HILIC分离结束后14分钟进行第二次阀门切换，在连接MS检测器的RPLC上分离样品环的分析物，主要包括激素和农药(图3-2b)。2D-LC系统可以分离多类禁用物质，极性覆盖范围广。图3-2c展示了2D-LC方法获得的典型色谱图，该方法结合了HILIC和RPLC分离模式的特点，表明所建立的方法可以成功扩大分析范围。

 

图3-3  30个化合物在2D-LC法中的一维HILIC 分离(A)和常规RPLC法 (B)分离的色谱图比较。

研究中比较了2D-LC和传统1D-LC方法分离的目标化合物的数量，2.1 分钟前洗脱的疏水分析物在HILIC柱上出现明显的共洗脱(图3-2a)，在2D-LC方法中可以获得较好的分辨率(图3-2c)。图3-3b显示，在RPLC中，9种保留较差(1.2分钟内)的分析物出现共洗脱，21种化合物出现双峰或峰分裂，导致定量不准确。而在2D-LC方法中，这些化合物可以在HILIC柱上得到很好的分离(图3-3a)。在1D-LC方法中保留较弱的化合物或共洗脱物质可以通过结合两种不同的分离机制在2D-LC中得到改善。

表3-1 样品中违禁物质的分析结果。

应用建立的2D-LC-MS方法对在超市购买的12种化妆品中的126种禁用物质进行了筛选。被测试的化妆品包括爽肤水、保湿霜、洁面乳、沐浴露、面霜、修护霜、粉底、定型粉、面膜和卸妆产品。在筛选的化妆品中，沐浴露和粉底样品中检出的吗啉和异恶唑草酮的浓度分别为5.39和14.25 μg/g(表3-1)，这两种化妆品样品的 MRM 谱图如图3-4所示，这些化学物质在化妆品中是禁止使用的。

图3-4  (A)样品5中的吗啉; (B)样品8中的异恶唑草酮。

本研究建立了一种基于稀释调制的2D-HILIC/RPLC-MS同时测定化妆品中126种禁用物质的方法，将HILIC和RPLC分离相结合，扩大了分析物的覆盖范围。在稀释调制的作用下，一维HILIC中的强溶剂被稀释为与二维RPLC中流动相初始比例相似的弱溶剂，从而减少了溶剂不相容的负面影响。本研究建立的在线2D-LC-MS方法是一种自动、灵敏、高效的大范围筛选化妆品禁用物质的方法，具有良好的应用前景。

参考文献

1. LC–MS method for the simultaneous determination of six glucocorticoids in pharmaceutical formulations and counterfeit cosmetic products. Jessica Fiori et al. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2014. 91:185–192.

2. Screening, characterization, and determination of suspected additives bimatoprost and latanoprost in cosmetics using NMR and LC–MS methods. Yong Lu et al. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2023. 415:3549–3558.

3. Diluting modulation-based two dimensional-liquid chromatography coupled with mass spectrometry for simultaneously determining multiclass prohibited substances in cosmetics. Liping Zhang et al. Journal of Chromatography A. 2023. 1695:463954.