qPCR数据可用性判断及数据处理方法 - 知识概念 - 实验与分析

qPCR数据可用性判断及数据处理方法

张明 0 2024-04-24

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qPCR数据可用性判断及数据处理方法

如何判断qPCR数据是否可用？

判断依据1，Ct值在合理范围内

Ct值的定义：PCR过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。

特别是目的基因的Ct值如果超过了35，也可以用，但是可能会影响最后实验结果的判断。所以Ct值偏大最好重复一遍。

a. Ct过大：通过提高模板浓度等进行改善；

b. Ct过小：通过稀释模板等进行改善。

判断依据2，溶解曲线（Dissociation curve）

Ct当然是首要看的数据值，但是紧接着就要看溶解曲线了，如果溶解曲线不对，那么Ct再好都要重来。

熔解曲线上有特征峰（Tm，DNA双链解链50%的温度），一般通过熔解曲线判断扩增产物是否单一。

1）TM在75-90之间；

2）单峰无杂峰；

3）峰距在5个TM内最好。下面展示比较好的例子

下面是异常的溶解曲线，如果是下面跑出来的Ct值，是肯定要重新做的。

熔解曲线主峰前有杂峰

可能原因：存在比目的片段短的非特异性片段，也有引物二聚体的可能，此种情况下大概率需要重新设计引物了。

熔解曲线主峰后有杂峰

可能原因：大多由非特异性扩增引起，存在比目的片段长的非特异性片段。可通过调整稀释倍数、减少引物等来进行调整。

熔解曲线的问题，小伙伴们还是主要注意，引物设计和浓度是否有问题，同时操作时注意污染和镁离子浓度是否过高。

判断依据3，扩增曲线（Amplification curve）

扩增曲线（Amplification curve）：随着PCR反应的进行，荧光信号强度随着扩增产物的增加逐渐增强，通过荧光强度检测扩增产物量的变化。

理想的扩增曲线是S型，有明显的四个时期

1）曲线具有平台期；

2）Fluorescence至少在3以上；

3）曲线无二次抬头。

下面这个是好的例子

1. 没有对数增长期的扩增曲线，无Ct值

可能原因：引物或探针降解；模板量不足或模板降解。建议试剂不要反复冻融；

2. Ct值出现过晚的扩增曲线

可能原因：扩增效率低，建议各位小伙伴可以使用核酸电泳优化反应条件，比如降低退火温度；（当ct值较大>38，本人试过在反转录时即采用特异性引物进行反转录，并加大核酸浓度，效果有所改善）

3. 扩增曲线出现向下或向上的尖峰

可能原因：反应过程中电压不稳定，也可能为卤素灯老化。平时我们大体看前面两个依据就够了，但是qPCR跑完了，最好这三个都留意下，这三个都没有问题，qPCR可以大胆进入下一步进行计算了。

qPCR数据处理方法

上个讲到判断qPCR数据是否可用，Ct出来如何计算相对表达量呢？

对于qPCR数据的分析主要是绝对定量和相对定量。

1. 绝对定量主要使用标准曲线的方法；对于科研小伙伴们，主要通过相对定量来分析目的基因的表达差异。

2. 相对定量，主要使用的方法为双标曲线法和2^-△△Ct

首先要明白的就是Ct值的定义：PCR过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。

因此分析定量时目的基因Ct值取15-35较好，内参基因的Ct值一般在13-15左右较好。需要注意的是：平行孔之间Ct值相差不要超过0.5，这也是为何建议设置3个平行孔的原因。

目前计算基本上按照这个公式进行

公式=2^-ΔΔct

如果Ct值出来了，我们可以按照如下步骤一步一步来

1）求出所有样本ΔCt：目的基因Ct－内参基因Ct；

2）求出对照组ΔCt均值：使用函数 AVERAGE；

3）算出所有样本ΔΔCt: 单个样本ΔCt－对照组ΔCt均值

4）表达水平的差异倍数2^-ΔΔCt: 表格使用函数=POWER (2，-ΔΔCt)

举个例子

第一步：求出所有样本ΔCt：目的基因Ct－内参基因Ct;

第二步：求出对照组ΔCt均值:使用函数 AVERAGE

第三步：算出所有样本ΔΔCt: 单个样本ΔCt－对照组ΔCt均值

最后一步：最后2^-ΔΔCt: 表格使用函数=POWER (2，-ΔΔCt)

最后的G列的数据就是用来作图的值。

qPCR是实验中经常要分析的数据，仅次于表型考察数据的分析。

这个计算的Excel第一次计算好就可以了，后面来了新的数据可以直接替换数据，公式都还在，可以快速获得结果，不用像这样1,2,3,4操作。

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内容来源：Super Lab

责任编辑：展源

审　　核：何发

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