掌握装柱技巧助力装出高柱效的柱子

赵桂芝 0 2024-07-31

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柱层析是世界各地实验室中最常用的纯化技术。如果做得好，它可以简单快速地从混合物中分离出所需的化合物。但是，与许多化学实践一样，快速有效地设置和运行色谱柱可能需要数年才能掌握。在这里，小编将提供了一些柱层析的小tips和技巧，对柱层析过程中常遇到的一些问题进行故障排除并给出替代方案。

装柱准备

填料准备

a.根据需求确定柱体积，通过公式计算所需填料体积。

通常情况下填料的压缩因子在1.1-1.18之间，填料出厂时的胶悬液浓度为50%，建议装柱时将胶悬液浓度控制在50%-70%。

b.换液：将填料静置后待填料与缓冲液充分分层，将上层保护液倾去，补加适量纯化水，重复两到三次。

c.除气/匀浆：可通过匀浆棒上下捣动均匀分数填料，同时达到一定的除气作用。

注：如有匀浆罐，可借助匀浆罐完成换液、除气，匀浆工作。

层析柱及层析系统准备

a.检查层析柱及层析系统选型是否匹配。

b.使用前对层析柱、层析系统进行清洗，检查层析柱安装是否水平、密封性是否良好、筛网尺寸是否适用。

装柱流程

手动层析柱

1.层析系统及管路排气。

2.柱底筛网排气：将柱底连接层析系统，通过下进上出冲出底部气泡，顽固气泡可通过外接恒流泵吸出。关闭柱底阀，柱底留1-2cm 纯化水。

3.将匀浆好的填料一次性均匀引流进入层析柱，静置一段时间。

4.柱顶筛网排气：将柱头固定至支架上，安装柱顶四通阀，A口为系统进液口，B口为层析柱进液口，C口为排废口。按下图将流路调节至A→B，开启流速，排尽柱头气泡，顽固气泡可通过外接恒流泵吸出。气泡排尽后观察分配盘分液是否均匀，筛网是否紧固。

层析柱四通阀示意图

5. 待填料沉降至上方出现3-5cm澄清液面后，将柱头移至层析柱上方，缓慢下落上柱头至液面下方，注意不要引入气泡，柱头及筛网上附着的气泡可通过轻轻摇晃柱头去除，如仍有顽固气泡，可重复本步骤，直至气泡消除。

6.拧紧上柱头密封圈（不宜过紧，密封即可），通过层析系统进行低流速压柱（通常为30-60cm/h），使填料充分沉降，标记胶面位置。

7.根据压缩系数计算最终柱高，将四通阀流路切换为B→C，拧动螺杆将柱头下落至计算值（下落时保证密封圈有一定密封性，切勿使填料通过密封圈漏出），最后充分密封胶圈，将四通阀流路切回至A→B。

电动层析柱

电动层析柱的装柱流程基本与手动层析柱一致，需要注意的是电动层析柱的排气方式受层析柱结构的影响，每个厂家的设计都略有不同，在装柱前请根据厂家的指导进行排气操作。

干法装柱与湿法装柱

装柱子（添硅胶）时，常用的有两种方法：即湿法装柱和干法装柱，二者各有优劣。不论干法还是湿法，硅胶（称为固定相更为广义）的上表面一定要平整，并且硅胶（固定相）的高度一般为15cm左右（长度没有绝对之说，根据自身情况而定，制备的大柱可以长达一米），太短了可能分离效果不好，太长了也会由于扩散或拖尾导致分离效果不好。

湿法装柱是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后，再填入柱子中，然后再加压（土方法可以用养鱼的氧气泵加压或是用氮气，当然不加压也可以）用淋洗剂"走柱子"，本法最大的优点是一般柱子装的比较结实，没有气泡。

干法装柱则是直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧（湿法也要敲的，效果好点），至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度，最后再用油泵直接抽，这样就会使得柱子装的很结实（一般柱子不敢用油泵抽，怕把柱子抽裂了）。接着是用淋洗剂"走柱子"，一般淋洗剂是采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。通常上面加压，下面再用油泵抽，这样可以加快速度。干法装柱较方便，但最大的缺陷在于"走柱子"时，由于溶剂和硅胶之间的吸附放热（可以用手摸柱子明显感觉到）（梯度洗脱时，湿法装柱也会出现该情况，比较不好处理，可以缓慢改变溶剂，且置于通风处），容易产生气泡，这一点在使用低沸点的淋洗剂时如乙醚（用乙醚最最明显），二氯甲烷更为明显。虽然产生的气泡在加压的情况下不易察觉，但是，一旦撤去压力，如在上样、加溶剂等操作的时候，气泡就会释放出来，严重时，整个柱子变花，样品不可能平整地通过，当然也就谈不上分离了。解决的办法是：

第一、硅胶一定要压结实；

第二、一定要用较多的溶剂"走柱子"，一定要到柱子的下端不再发烫，恢复到室温后再撤去压力。

也有介绍在硅胶的最上层填上一小层石英砂(我一般垫张滤纸，撒上石英砂，再放些棉花)，防止添加溶剂的时候，使得样品层不再整齐。但我的感觉是如果小心上样，添加溶剂，则没有这个必要。

干法上样与湿法上样

湿法上样

1. 将样品溶解在最少量的溶剂中（5-10滴）。此处允许使用比洗脱溶剂稍微更极性的溶剂。如果您需要使用二氯甲烷或更强的溶剂，可能优选下述干法上样方法。

2. 使用注射器或吸管将样品直接滴到硅胶的顶部。尽量不要扰动硅胶表面，理想情况下，样品应在表面上均匀分布，以便形成薄的水平带。

3. 添加完整个样品后，让色谱柱排出，使溶剂水平接触二氧化硅顶部。

4. 使用移液器小心添加更多溶剂，使溶剂水平高于沙子顶部约10 mm。

5. 让这种溶剂排出，直至溶剂水平高于砂子顶部约1-2毫米。

6. 重复步骤5和6一次或两次。这将确保您的样品被吸收到二氧化硅上。

7. 最后，根据需要添加尽可能多的溶剂，然后就可以开始运行列了。