微生物培养平板倒置？

张明 0 2024-12-05

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培养平板微生物

很多小伙伴进入实验室的第一课是学习培养基的配置，制备平板，制备好的平板需要倒置，相信大多数小伙伴都很困惑为何需要倒置？

一、微生物培养平板为何倒置放？

微生物培养中，平板需要倒置放置，高中生物学选修教材中有关平板培养细菌的内容中，关于平板冷凝后要将平板倒置的原因，主要概述为“平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置，既可以防止皿盖上的水珠落入培养基，又可以避免培养基中的水分过快的挥发”。除此之外，还有些主要原因有以下几点：

（1）可避免培养基与培养皿脱离

倒完平板后，由于培养基尚有余温且刚凝固不久，水分较大、湿度较高，皿盖上会凝结一些水珠。如果平板正放，则冷凝的水滴会流到凝好的培养基里，容易造成污染，还会使培养基和皿出现分离，很容易滑动，导致培养基与培养皿黏附不牢。

如果倒平板时培养基水分较大，在接种培养时，培养基中的菌种会四处流动，长成的菌膜连在一起，不能计数。

（2）平板倒置拿取方便

在取放平板时，如平板正放，一不小心会将培养皿与皿盖碰开，造成污染；而倒置的平板在拿取时能够保持原状，避免环境中杂菌的污染。

（3）利于菌种的生长和繁殖

倒置培养可以减少培养基表面空气流动，减慢培养基中水分挥发的速度，保持琼脂等固体培养基中的水分，充分维持琼脂等凝固剂的弹性，延长培养基基出现干裂的时间。所以，倒置培养有利于菌种的繁殖和生存。

（4）防止培养过程中杂菌污染

一方面，倒置培养皿可以防止培养皿盖上的冷凝水滴落到培养基中，避免微生物的交叉污染。

另外一方面，平板倒置培养时，由于平板内的空气不易流动，能尽可能的减少外来杂菌的侵染，避免杂菌污染培养基和培养物。

（5）有利于营养物质富集，方便观察计数

平板倒置进行微生物培养时，受重力的影响，一方面培养基中的营养物质主要会富集在培养基表面及表面以下的次层，有利于微生物生长；另一方面培养基表面生长的菌落相对不会太快扩散，观察时有利于辨别菌落特征。且倒置培养时水珠也少，方便观察计数。

倒平板操作步骤及操作要点：

I 操作步骤

（1）将无菌培养皿（一般使用9 cm皿）放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰。

（2）用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约10~20 mL）倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖，轻轻摇匀。

（3）等待平板冷却凝固（大约需5~10 min）后，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。

图1 倒平板操作示意图

II 操作要点

（1）确认温度

固体培养基倾注的温度在45℃~50℃。主要操作技巧是用手心轻轻碰一下盛固体培养基的三角瓶，感觉不烫，然后用手背也感觉一下，感觉烫手，这时的温度大概是50℃。

（2）预防培养基气泡产生

灭完成后，琼脂粉分布不均匀，需要摇匀。

等试剂温度降至45~50℃，再加入抗生素等试剂，轻轻沿壁摇匀，让培养基整体沿着同一个方向摇起来，直到摇匀为止。

用微波炉等加热设备重新加热一下，温度高了气泡也就从培养基中跑出来啦。

（3）培养基厚度

以90 mm培养皿为例，直径90 mm、内高度约14~15 mm（没有详细测量），可以盛放100 mL水（实际测量）。

倒平板的时候大概20~25 mL，20 mL对应高度约3 mm，25 mL对应高度约4 mm。所以，可以根据高度大概确定培养基厚度。这是第一个方法。

倒平板的时候，铺满整个培养皿底部，稍微再倒一点点就是20 mL，再稍微多倒一点点就是25 mL，这个需要经验，多倒几次就能把握。这是第二个方法。

二、平板划线技术操作步骤及解析

I 操作步骤：

（1）将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。

（2）在火焰旁冷却接种环，并打开盛有菌液的试管的棉塞。

（3）将试管口通过火焰；将已冷却的接种环伸入菌液中，沾取一环菌液；将试管口通过火焰，并塞上棉塞。

（4）左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划3至5条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。

（5）灼烧接种环，待其冷却后，从第1区域划线的末端开始往第2区域内划线。重复以上操作，在3~5区域内划线。注意不要将最后1区域的划线与第1区相连。

（6）将平板倒置，放入培养箱中培养。

II 步骤解析：

（1）操作每一步前后灼烧接种环

操作开始时灼烧接种环，是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线之前灼烧接种环，是为了杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使下一次划线时接种环上的菌种直接来自上次划线的末端，通过划线次数的增加而使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落；划线结束后灼烧接种环，及时杀死接种环上残留的菌种，防止污染环境和感染操作者。

（2）如何让初学者在划线无痕的平板上确定5个区域

由于平板冷却凝固之后，是倒过来放置的，正好使得皿盖在下皿底在上。可以在皿底的背面用记号笔将平板分成面积不等的5个小区域（图2），第1区面积最小，作为待分离菌的菌源区；第2、3、4区是逐级稀释的过渡区；第4~5区是关键区，通过划线操作使该区出现大量的单菌落以供挑选纯种用。平板上5个区面积的分配应是5＞4＞3＞2＞1。待到划线接种时，操作者就可以将接种环沿着记号的顺序和位置进行划线，这样既能保证第2、3、4、5次划线都是从上一区域的末端开始，而且第5区域和第1区域不相连，又能便于充分利用整个平板的面积，得到较多的典型单菌落。

图2 平板划线的5个区域

（3）如何界定平板划线技术是否合格

培养24 h后观察平板，需保证：

① 平板应无杂菌污染。

② 划线应为直的，且每一线都接近平板边缘，平行的线和线之间要紧密，但不能搭在一起。

③ 要有较多的单菌落，至少应有10个以上的单菌落方为合格。

三、平板涂布技术操作及步骤解析

I 操作步骤：

平板涂布是一种常用的微生物接种方法，主要用于样品中的菌落计数、培养基的灵敏度验证及细菌的分离培养等。平板涂布是将少量（通常不超过0.1 mL）系列稀释的菌液涂布在预先倾注好的固体培养基上，靠涂布棒在琼脂表面均匀铺开，培养后获得菌落个数的一种计数技术。平板涂布的操作如下：

（1）无菌准备

①提前对无菌室及生物安全柜进行紫外线消毒灭菌。

②操作者需穿专业的实验服，且衣着和手均需喷洒75%酒精消毒。

③将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌处理。

（2）涂布前的准备

①将涂布器浸在盛有75%酒精的烧杯中进行消毒。

②取出保存在4℃的预制平板，可放置37℃培养箱中预培养±0.5 h，使平皿回温，并使平皿表面保持相对干燥，防止涂布时水分过多造成菌落蔓延成片。

（3）涂布操作

①吸取适量样液或菌液滴加到培养基表面，建议每皿的加样量不超过0.1 mL。

②取出用75%酒精消毒后的涂布棒，略微晾干后，置酒精灯火焰上方灼烧灭菌，将灼烧后的涂布棒置于无菌空白平皿中冷却，再将平皿表面滴加的菌液均匀涂开。

（4）涂布后的培养

①涂布结束后，需将涂布棒再次蘸取酒精，灼烧灭菌后，再进行下一个样品的涂布操作。

②涂布完成后，待平皿表面液体晾干后，使菌液渗透入培养基内，翻转平皿，然后将平板放置于恒温培养箱中倒置培养。

II 步骤解析

（1）全程操作必须严格控制无菌操作环境，且所有操作需要在酒精灯火焰旁。

（2）始终保持涂布棒的涂布一端向下，并且涂布棒上的酒精既要覆盖全部即将深入平皿的部位又不能滴淌。涂布棒从酒精中取出时，沥净涂布棒上的酒精，然后再通过酒精灯火焰点燃。防止酒精倒流或溅溢引燃物品或烧到手。且涂布棒使用前后均需过浸泡酒精并通过火焰点燃灭菌。使用前进行浸泡酒精火焰灼烧灭菌是避免杂菌污染样品，造成交叉污染。使用后进行灭菌是避免影响无菌环境。

（3）左手将皿盖在酒精灯火焰旁边打开一个缝隙，右手将灼烧过的涂布棒涂布一端靠在皿盖上冷却。冷却后将平皿盖开大一些，用涂布棒刮样液在培养基表面均匀涂布开。涂布的时候，涂布棒不能触碰平皿内侧边缘。如果有条件，涂布过程应将平皿置于旋转的涂布台。

（4）涂布力度，大小适宜，不应划破培养基的表面。如果发现平板上水太多，需要处理后再使用，避免造成交叉污染。

内容来源：质谱学堂

责任编辑：展源

审核人：何发

内容来源：雪子赟

责任编辑：展源

审　　核：何发

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