质粒为什么要挑单克隆，冻存的菌液是否需要再次挑单克隆？

张明 0 2024-12-12

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质粒挑单克隆菌液

在质粒构建中，同一质粒有两个单克隆都链接成功，那么是否可以将同一质粒的两个不同克隆，混在一起进行扩增呢？

答案是：不能！

在质粒构建过程中，挑选单克隆的原因主要有以下几点：

在质粒转化到细菌细胞后，质粒会在细胞中复制扩增。然而，扩增过程并不总是完美无缺，可能会产生一些突变或重组。挑选单克隆可以确保获得的质粒来自于同一个起始质粒，减少了混杂基因型的风险，从而确保了基因序列的准确性。

如果不挑单克隆，可能会出现多个质粒的混合情况，大大增加了我们质粒的突变风险！。 单克隆培养意味着所有细菌细胞都携带相同的质粒，这样可以确保后续的实验在相同的遗传背景下进行。特别是在进行蛋白表达实验时，质粒的拷贝数和基因表达水平直接影响实验结果。

那么，用甘油储存的甘油菌需不需要在固体培养基中再次挑选单克隆？

如果是需要进行质粒构建的实验室，最好每次冻存菌株取出后，要进行单克隆筛选，这样才能确定载体在一代代的重组后，最少程度的突变。当然，原始质粒的储存也非常重要！

如果你有经过验证、序列确认且保存在甘油中的菌液，并且不用于质粒构建，通常可以直接用于扩增，而不必每次都进行涂板单克隆选择。甘油管中保存的菌液在-80°C条件下稳定性较高，短期内不会轻易发生突变或丢失质粒。

即使直接用储存菌液，也建议定期对质粒进行序列验证，特别是在长期储存后重新使用时。菌液存储时间越长，质粒突变的可能性越大，所以每隔几次扩增后可以考虑重新涂板挑选单克隆。

对于高拷贝数质粒，丢失的可能性较低，因此可以考虑直接从储存菌液中扩增，但仍需定期筛选单克隆，以确保质粒没有发生突变。低拷贝数质粒相对不稳定，直接从储存菌液中扩增的风险较高，通常建议在这种情况下每次都重新涂板筛选单克隆。

另外，在操作过程中，每次扩增时如果不涂板筛选单克隆，可能会带来污染的风险。如果使用的储存菌液中含有其他细菌或质粒，会影响实验的准确性。定期进行单克隆筛选有助于降低这种风险。

如何挑取单克隆

1.划线前需要准备的材料

在正式开始培养前，我们需要收集一些必要的材料。

首先是含有你感兴趣质粒的甘油菌或穿刺菌；
其次是含有合适抗生素的LB琼脂平板；
无菌的牙签或者无菌的接种环；
酒精灯或其他火焰；
30或37摄氏度的干燥培养箱；
最后是良好的无菌操作技术。

2.划线培养方法

首先，我们取出含有适当抗生素的LB琼脂平板，确保平板上没有污染并且干燥。

如果平板上有水珠，你可以把它打开然后放在火焰下约10分钟来风干。接下来，我们要看一下我们的穿刺菌，确保其中有可见的细菌生长。然后取一个无菌的牙签，把它插入并接触到有细菌生长的穿刺区域，这个过程也可以是将无菌的牙签浸入到半融化的甘油菌当中。请注意的是，在牙签上你不需要看到肉眼可见的一团细菌，看起来很干净的牙签表面可能已经被细菌充分覆盖了。

用牙签轻轻地从平板的边缘附近开始划线，牙签与平板接触角度大概在45度左右。

请注意一定要轻轻的划线，不要用牙签刺破平板，否则你就会在划线过程中将琼脂翘起来。在划线时要遵循一定的路径，并且需在每个新路径开始时用一根新的无菌牙签。用第一根牙签划线时，我们需要轻轻地连续划线大约至1/3平板大小，并注意避免碰到平板的边缘。扔掉第一根牙签，并转动平板，然后使用一根新无菌牙签从上一次结束的地方开始连续划线约 1/3区域，并在靠近边缘的地方结束。

最后，我们用第三根牙签再重复一次这一过程。尽管，这个过程会很快，我们仍需要很细心。

需要确保在培养之前平板是完全干燥的。

这是由于，如果细菌在平板上是一层液体的话，它们有可能会在平板上扩散并形成一层菌群而不是单个的菌落。需要注意的是，要将平板倒置放入培养箱中，以避免冷凝的液体会滴到菌落上而干扰它们的生长。现在我们已经完成了划线，我们将平板倒置放入培养箱中过夜或者至少培养12小时。

你可以看到我们精心划线后会有单个菌落出现，之后就可以挑取单个菌落以便用于下游各种各样的实验。

内容来源：小桔的笔记本中源生物

责任编辑：展源

审　　核：何发