近日，美国斯坦福大学的亓磊实验室在Nature杂志在线发表了题为“Programmable control of spatial transcriptome in live cells and neurons”的研究论文，开发了一种新型的可编程方法来调控内源RNA的空间定位，该方法称为CRISPR介导的空间转录组调控技术（CRISPR-mediated transcriptome organization, CRISPR-TO）。该项研究为系统性地研究内源RNA定位在多种生物学体系中的功能提供了全新的工具。

CRISPR-TO利用II类VI型CRISPR-Cas13系统进行空间转录组的调控。II类VI型CRISPR-Cas13系统是一种在RNA引导下靶向RNA的核糖核酸酶（RNA-guided, RNA-targeting ribonuclease）。通过突变Cas13的核糖核酸酶结构域可以获得其失活变体dCas13 (dead Cas13)。dCas13能够高效且特异性地结合目标RNA，而不会导致其降解。利用这一可编程性，作者开发了CRISPR-TO，将dCas13与介导亚细胞定位的信号肽段/蛋白或马达蛋白（motor protein）通过化学诱导的异二聚化机制（heterodimerization）相结合，通过两种模式—被动扩散与停靠（passive diffusion and docking），以及主动运输（active transport）—实现了可诱导、可逆的靶向RNA定位。

CRISPR-TO技术的核心优势在于其能够在不改变基因序列的前提下，轻松实现对内源RNA分子亚细胞定位的精准时空调控。利用CRISPR-TO，作者成功实现了对内源RNA（包括mRNA和noncoding RNA）在不同细胞类型中多种亚细胞区室的空间靶向定位调控，包括线粒体外膜，P-小体（p-body），应激颗粒（stress granule），端粒，核应激小体（nuclear stress body），以及由马达蛋白介导的沿微管进行的双向主动RNA运输。而通过将CRISPR-TO与活细胞RNA成像技术相结合，作者实现了对活细胞中RNA定位动态的实时操控和观测。在研究过程中，作者发现将mRNA靶向定位到P-小体显著降低了mRNA的降解常数，并延长了mRNA的半衰期。这些结果为尚存争议的P-小体功能提供了关键实验证据，支持了“P-小体的主要功能是mRNA存储位点而非降解场所”的理论。

除了肿瘤细胞系，作者还在体外培养的原代小鼠皮层神经元（primary mouse cortical neuron）中利用CRISPR-TO成功实现了内源mRNA在活细胞中的超长距离（约1 mm）运输。此外，该系统还可以通过共表达多个向导RNA（gRNA）轻松实现对多个mRNA的共同运输和定位调控，以研究其协同作用，而这种协同调控利用以往任何一种方法都很难实现。作者通过超分辨成像技术成功观测到了被CRISPR-TO运输的内源β-肌动蛋白mRNA（ACTB mRNA）与核糖体共同运输，并在神经突和神经突末端进行局部翻译。有趣的是，将内源β-肌动蛋白mRNA定位到神经突末端迅速增强了动态丝状伪足突起（filopodial protrusion）的形成，同时抑制了损伤后轴突的再生。

a-b, CRISPR-TO在细胞系（a）和神经元（b）中的工作原理示意图。c, 利用CRISPR-TO在原代小鼠皮层神经元（白色）中实现对内源β-肌动蛋白mRNA（红色）沿神经突的超长距离运输。

该项研究的另一大重要突破在于，CRISPR-TO技术的可编程性使其能够进行高通量筛选（high-throughput screening），从而使空间转录组功能的系统性研究成为可能。作者进行了基于CRISPR-TO的阵列化筛选，以评估21种内源mRNA在原代小鼠皮层神经元的神经突中的定位对神经突生长的影响。通过自动化高内涵显微成像（high-content automated microscopy）对神经突生长进行追踪，作者发现将Stmn2 mRNA运输定位到神经突可以驱动神经突的快速生长。Stmn2 mRNA编码微管结合蛋白Stathmin-2，参与微管动力学和突触再生，并且和肌萎缩侧索硬化（ALS）的病理过程有关。此前通过微阵列分析观察到Stmn2 mRNA的轴突定位，但其功能意义仍不清楚。本文作者通过RNA荧光原位杂交（RNA FISH）和不同条件下对神经突生长实验的重复，成功验证了CRISPR-TO介导的Stmn2 mRNA在神经突中的富集，并验证了上述亚定位变化对神经突生长的促进，为治疗肌萎缩侧索硬化症提供了新的研究思路。

通过对空间转录组进行精准、可逆和大规模的时空调控，CRISPR-TO弥合了现有测序和成像技术留下的关键空白，提供了一个高通量研究空间转录组功能的平台，未来将极大地促进不同生物学系统和疾病背景下对空间转录组的功能研究。

作者简介：亓磊（通讯作者），斯坦福大学生物工程系的亓磊教授。2001年考入清华大学，就读数理基础科学班，2005年毕业并获得学士学位。2006年赴美国留学，进入加州大学伯克利分校物理系攻读研究生，师从朱棣文教授，2007年获得物理学硕士学位。同年转入生物工程系攻读博士学位，师从合成生物学先驱Adam Arkin和CRISPR先驱Jennifer Doudna。2012年获得生物工程学博士学位 。2014年底，加入斯坦福大学，任生物工程系、化学和系统生物学系任助理教授。同时他也是多个斯坦福研究所的研究成员，包括Stanford ChEM-H（斯坦福化学、工程学与医学研究所）、Stanford Neurosciences Institute (斯坦福神经生物学研究所)、Bio-X（生物交叉学科研究所）、以及Stanford Cancer Institute（斯坦福癌症研究所）。韩梦婷（第一作者）博士本科和博士毕业于北京大学化学与分子工程学院，博士阶段导师为陈兴教授，现为斯坦福大学生物工程系博士后。

文章来源：仪器信息网