共振质量测试法的生物应用

Lisa Newey-Keane 0 2020-05-27

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RMM

预测和测量蛋白质聚集，是生物制药配方中的一个重大难题。共振质量测试法——一种新型的分析方法，可以方便地研究蛋白质的聚集。

RMM技术用于蛋白质聚体的预测和测量

预测和测量蛋白质聚集，是生物制药配方中的一个重大难题。共振质量测试法——一种新型的分析方法，可以方便地研究蛋白质的聚集。

共振质量测定技术

共振质量测量主要是依靠一个可以检测质量变化的机械共振结构。质量增加或减少，可以使结构的共振频率上升或下降。由于可对频率进行非常精确的测定，这就为测量质量提供了基础。为了测量悬浮在液体上的微小颗粒的质量，共振器内置了微流体通道。当悬浮颗粒通过该结构时，它会改变共振器的整体质量，由此改变其共振频率。如图1所示，颗粒在位置1时进入共振器。当颗粒到达共振器末端的位置2时，对共振频率造成的偏移达到最大值。而当颗粒在位置3退出时，共振频率又恢复到基准线。

图1.在流体中测量粒子质量。

通过测量共振频率对基准线的偏移，可以实现对粒子质量的测量。对于具有上浮力的微粒，如油滴，则可以观测到相反的效果，共振频率会相对于基准线发生正偏移。

采用共振质谱测量非常小的颗粒，需要使用自身质量很小的共振器。在马尔文阿基米德系统中，MEMS(微机电系统)传感器能满足这一要求。每个传感器芯片包括一个微流体网络和一个微小的悬臂，以一个特定的频率发生共振。悬臂中内置一个微流体通道。当仪器中的流体系统将样品推送经过通道时，悬臂的共振频率会发生变化。共振频率的变化通过激光测量，先聚焦到悬臂的顶端，然后将其发送到一个分离光电二极管探测器。

图2.共振质谱测量仪器的配置(马尔文阿基米德系统)。

每个粒子穿过传感器都会引起一次共振频率的变化，从而得到对样品中单个颗粒浮力质量精准的测量，无论这个数据是正是负。通过这样的测量，可以计算出粒子的质量、粒径(等效球)以及表面积。同时也可对样品浓度、密度、体积和多分散性进行整体测量。

RMM技术可进行粒径测量

在药物研发的经费支出比例中可以看出，生物分子的研究工作所占比重越来越大，因此分析测试也在生物制药行业变得越来越重要。分子技术的开发不仅成本高，且受到严格监管，所以急需一套严谨适用的分析测量方法。因为缺少好的分析方法，很可能会限制药物的研发。

与小分子药物不同，蛋白质制剂是非合成或非结晶的，其本质上是不均匀的。因此，对生物疗法的纯度和效力做出判定，相对于非生物分子更加复杂，以聚集体形式、错误折叠构象形式，或是完全变性结构形式存在的生物分子等杂质都有可能成为杂质的来源。对药物配方进行质量控制和保证所需的分析技术，则和小分子药物的分析技术完全不同。分析方法的适用性和多变性，不仅给制造商，同样也给监管机构带来了许多新的挑战。

挑选合适的候选分子时会涉及到很多物理化学测试过程，以排除那些下游“问题分子”。这些分子将会在配方中有怎样的表现?监管机构对直径为0.2μm~2μm的蛋白质聚集体可能引发的潜在免疫原性也很关注，但现有的粒径测定技术，让我们知道有这种粒径的存在，尚不足以提供这一领域的量化数据。被应用于马尔文阿基米德系统的共振质量测定(RMM )技术能弥补这一缺陷，它不仅可以进行粒径测量，更重要的是能对直径为50nm~5μm的粒子进行计数。

蛋白质聚集体的定量测定

起初，蛋白质聚集体处于二聚体水平，此后直径一路攀升到数十微米，高于这一范围上部的聚集体通常采用流量式显微镜来测量。共振质量测量可应用于低于流式显微镜测量范围的领域，包括那些粒径在亚微米至几微米的粒子、以及不易通过其他方法评估测量的粒径。

图3.(自左至右为a、b、c，利用马尔文阿基米德系统进行聚集体检测。

图3(a)为 4 µL配制缓冲液中，亚微米级IgG蛋白聚集体的粒度分布状况。使用RMM测量得出，粒径大于300nm的聚集体浓度为4×106/mL。因为测量是基于质量的，粒度分布可以用形成每种聚集体(图3(b))的蛋白质分子(已知质量的)数量来表示。图3(c)中列出的是，提高剪切应力一段时间后，对蛋白质样品的测量结果，如图所示，在整个实验过程中，从300nm到1μm范围内聚集体的浓度在不断增加，而亚微米聚集体的浓度与压力下制剂质量的好坏有关。

可用于检测污染物

蛋白质制剂分析中另一个流行的课题是硅油，它通常作为注射器或容器的润滑剂。硅油常常会混入制剂中，形成与聚集体大小接近的油滴。问题是，在某些测量方法中，油滴会被误认为是蛋白聚集体，有可能影响结果的准确性。

RMM可以通过浮力测量将硅油滴与蛋白质聚集体区分开来。