RiboPrinter^® 系统实现污染微生物的溯源

2013 年底，国家食品药品监督管理总局发布了一系列新政，对乳品，尤其是婴幼儿配方乳粉产品，全面加强了生产监管、流通监管和进出口监管，这一系列新的举措将在2014 年正式开始实施。

而对乳品企业而言，对环境监测和生产过程的控制比最终产品的检测更为重要，需要通过自动化的溯源技术，污染的来源、发生率、传播途径和菌株分布等各方面入手，开展致病菌和环境菌的风险评估和风险管理，才能真正保证产品的安全性。

乳粉企业潜在的微生物风险

有些乳品中常见的微生物，如克罗诺阪崎肠杆菌，对干燥环境有非常好的耐受性（Arku et al. 2008），并且可以在婴幼儿配方奶粉产品中存活相当长的时间（Edelson-Mammel et al.2005）。有研究表明，该细菌能形成生物膜（Biofilm）以抵抗恶劣的生存环境（Iversen etal.2004，Kim et al.2006），而且其在奶粉生产线的机械表面也有相当强的存活能力（Kandhai et al.2004， Guillaume-Gentil et al.2005）。

起先，研究者普遍认识到奶粉产品中阪崎肠杆菌污染的主要源头是原辅料和中间产品及其加工环境，但对具体的污染发生方式和传播路线并没有明确的概念，因此也就没有办法进一步提升生产风险的管控能力及产品的品质。直到2010 年，H.M. Craven 等人的研究小组借助菌株分型技术，对从澳洲5 家大型的乳品公司收集而来的阪崎肠杆菌菌株展开了较为全面的研究和调查，揭开了问题的答案，从阪崎肠杆菌污染的来源，发生率，传播途径和菌株分布等各方面入手，为我们绘制了一副明晰的微生物地图。

研究发现，克罗诺阪崎肠杆菌在5家工厂的环境中是普遍存在的。他们从298 份环境样品中的95 份样品中分离到了该致病菌（阳性率约为32%），这些样品中有49% 来自非加工区域，有29% 来自加工区域，共分离到菌株129株。研究者们用PFGE 将这些菌株进行了分型和指纹图谱的分析，共得到49个组别，并根据图谱的相似性发现这些菌株可随着空气、物料、生产人员的流动而广泛分布到整个生产区域内，因此十分有必要加强克罗诺阪崎肠杆菌的风险评估和监测，并及时开展干预以保障产品和消费者的安全。

RiboPrinter^® ：污染溯源新法

自动化的Ribotyping 技术已经在病原微生物的风险分析和关键点控制（HACCP）体系、GMP 体系、食品和药品安全质控和质保、常规检测、环境监测、法规制定和基础研究等领域引起了广泛的关注并得到了长足的应用。

随着美国杜邦公司RiboPrinter^®系统的问世，Ribotyping 技术实现了全自动化和标准化。因其出众的性能、简单快捷的操作体验，RiboPrinter^®系统已经成为世界众多微生物学、分子生物学实验室开展微生物鉴定和分子分型的首选设备，也是生产过程控制、洁净作业区及关键控制点监控、应急溯源、风险评估和预警的首选微生物鉴定和分型解决方案。

RiboPrinter^®系统的检测性能如下：

高通量，鉴定加分子分型8 小时内同步完成，应急溯源之利器，帮助企业在最短时间消除污染源，减少盲目处置造成的损失。

广谱的鉴定和分型系统，未知菌可直接上机分析，检测速度快，无需预检，企业因此具备了防范未知微生物污染的能力，从容应对突发事件。

通用标准试剂盒适用于所有已知和未知的细菌鉴定和分型，采购和库存管理更灵活方便，应急更迅捷。

自动化程度极高，操作简单，标准化检测程序内设，结果自动判读，非经验丰富人员也只需简单培训即可上岗，省下不必要的实验用地和设备，人员培训更简单，成本更低。

数据库容量为8528 个基因指纹图谱，包括1740 多个种和290 多个属，全部经过认证的标准菌株来源ATCC 美国模式培养物研究所、JCM 日本微生物菌种保藏中心和DSMZ 德国微生物菌种保藏中心。涵盖常见环境菌（如葡萄球菌、微球菌、芽孢杆菌、梭菌属等），致腐菌（芽孢杆菌、假单胞菌、明串珠菌、梭菌属等），致病菌（肠出血性大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、单增李斯特菌、弧菌、弯曲杆菌、阪崎肠杆菌等），更多发酵工业工程菌，益生菌（乳酸杆菌、双歧杆菌、乳球菌、嗜热链球菌等）。

出众环境监控和污染溯源：高分辨力，能在菌株水平分析微生物，帮助企业建立符合HACCP 和GMP 要求的微生物风险管理和污染溯源体系。

可建立全厂区的微生物地图：（1）帮助建立洁净作业区和关键控制点上的微生物地图，根据生产流程，在微生物敏感区和交叉污染区建立长期战略性采样计划及来自不同区域、设备、材料和人员的污染菌株数据库；（2）通过自动分析，了解在厂区中各种微生物的分布和流动趋势，更有效地评估和控制风险，修正管理体系的盲点和假点，对感兴趣的微生物进行溯源。

提供个性化方案研究：（1）探针个性化：适用于各种特殊微生物的鉴定和分型；（2）酶切个性化：可选择各种限制性内切酶，优化条件，实现分型的最高分辨率；（3）数据库个性化：支持用户自建库，实现数据平台的通用性和专一性。

RiboPrinter^®系统工作流程

RiboPrinter^®系统的应用对象从一开始就定位于工业化用户，操作设计非常贴心、简便和“傻瓜化”，避免操作者的主观因素对检测的影响，因此对操作者的培训和经验的要求不高。

工作流程如下：将各种来源的纯的单菌落样本直接挑出，使用通用的RiboPrinter^®系统试剂盒，按说明书的提示步骤进行操作，8h 给出鉴定结果和分子分型指纹图谱。若获得有记录的结果，直接给出鉴定信息，立即溯源；若获得未记录的结果，系统仍然给出高分辨的基因指纹图谱，用户可自行将该菌株的鉴定结果、来源、与其他数据库中菌株的同源性分析等信息建立信息档案，开展微生物调查和风险评估，获取更多的信息，溯源并开展纠偏行动，定期做好监测。

RiboPrinter^®系统采用通用试剂盒进行微生物鉴定和分型。用户只需将试剂放入仪器上相应的位置即可，是真正意义上的全自动工作站。当然，RiboPrinter^®系统是一个开放平台，为了个性化的工作需求，用户可使用个性化的酶切试剂和探针。

最后，仪器将自动进行结果分析，包括原始图谱，RiboPrinter^®基因指纹图谱，样品信息，批次信息，鉴定结果，与数据库中已有菌株图谱的相似度分析等一切用户感兴趣的信息。

RiboPrinter^®系统具有通量分析能力，8h内可完成32个样品检测。

RiboPrinter^®系统目前已经含有8528个标准菌株的基因指纹图谱，可以准确地鉴定各种微生物样本，数据没有盲点和模糊点。比可靠鉴定更有价值的是，RiboPrinter^®系统可以在菌株水平上区分每个菌株的指纹信息，从而快速追溯微生物污染源。

婴幼儿配方乳粉企业可利用RiboPrinter^®系统完善质量体系，绘制微生物随时间变化，在环境、人员、设备、样品之间的分布和移动路径图，建立四维微生物全环境档案，真正实现实时监测、污染溯源、风险评估和主动预警！

突发事件的首选

遇到突发性微生物污染事件时，用传统手工鉴定和分型方法至少需5 天时间，而RiboPrinter^®系统只需8h，应急处置之首选。

当微生物污染发生时，RiboPrinter^®系统可快速完成以下工作：

确定可能的污染源：超净台、水、移液器、检测设备、实验室环境、操作人员等。

在菌株水平鉴定、分型最终样品中的污染菌，获得菌株基因指纹图谱。

在各潜在的污染点采集样本，使用仪器追溯与之相同或相似的菌株。

凭借潜在污染源微生物指纹和最终样品中污染菌的指纹之间的同源性，确认污染源。

根据管理体系和关键点分析，采取正确的预防和控制措施，比如加强对高风险点的监测，建立战略性的采样计划和微生物趋势分析来保证检测结果的安全等。

企业污染物溯源案例

当病原微生物污染生产流水线后将非常难以清除，而准确、详细的微生物信息是企业对抗病原微生物的重要武器。这里列举一个例子，一家欧洲知名乳品企业通过使用RiboPrinter^®系统追溯阪崎肠杆菌污染源，更有效地降低微生物风险。

该企业的奶粉产品曾因受到低剂量的阪崎肠杆菌的污染，严重影响了产品质量，他们发现阪崎肠杆菌在复原乳中生长迅速，风险较大，希望搞清产品被污染的真正源头。虽然该企业三家工厂的生产设备大致是一样的，但生产程序却不尽相同。该企业的QC 人员发现其中两家工厂的最终产品中经常能培养分离到阪崎肠杆菌，而另外一家工厂则偶尔分离到该致病菌。于是他们针对这一情况展开了微生物调查。

他们从每家工厂的原料和环境试子中分离到了几百株阪崎肠杆菌样本，初步的生化筛选没有得到任何有价值的潜在污染源的信息，于是他们进一步使用RiboPrinter^®系统从菌株水平上分析这些致病菌株，获得了它们的基因指纹图谱。这些图谱很快帮助调查人员弄清了哪些菌株是三家工厂共有的，哪些菌株是某个工厂里独有的，并且这些菌株是怎样在工厂间传播的。

调查人员从中发现了重要的微生物污染源头的线索。比如，他们通过菌株的同源性分析，发现终产品中的污染菌和生产线上采集到的某一株菌株的同源性相当高，于是可以确认该生产点是导致终产品污染的源头，并且传播的方式是由于真空吸尘器和工人的流动造成的，QC人员很快采取了纠偏和预防措施。

更有趣的是，QC人员还发现该点的阪崎肠杆菌对现行的清洗和消毒程序有较好的耐受性，这是导致奶粉厂微生物持续暴发的真正原因。QC人员在RiboPrinter^®系统的个性化数据库里详细记录了这些污染菌株的详细信息，包括基因指纹，采集点和时间，流动趋势等，持续跟踪和监测污染菌的水平，确保了产品的质量安全。