从17世纪开始，现代生物学的发展就与显微成像技术紧密相关。然而，由于受光学衍射极限的影响，传统光学显微成像分辨率最小约为入射光波长的一半。因此，科学家们一直在不断努力，试图寻找突破光学显微镜分辨极限的方法。

　　在超分辨显微技术飞速发展的同时，现有成像技术的缺陷也日益显现，例如成像分辨率和成像时间不可兼得;对透镜制造技术提出了一定要求的同时，也限制了观测的视野;日益复杂的设备使得操作和维护也越来越困难……为了解决上述问题,需要发展一些新型的超分辨技术以适应不同领域的要求。

　　表面增强超分辨技术

　　现有超分辨技术在样品纵向图像的获取上可分为两类：

　　1. 通过增加可获取的信号纵深以更好地获取样品的三维图像，如双光子荧光显微技术等;

　　2.通过降低可获取的信号纵深以更好地获取样品表面的图像，如等离子结构照明显微技术(PSIM)和基于芯片的宽视场纳米显微术(CWN)等。

　　下面主要介绍第2类技术中的两种新型前沿显微技术，二者都是利用特殊材料的样品作为载物台对照明光进行有效的调制，以增强样品表面的成像效果。

　　等离子结构照明显微技术

　　PSIM是于2014年由WeiFF等在传统结构光照明显微(SIM)原理的基础上利用表面等离子体干涉(SPI)代替光学干涉，从而获得达到SIM两倍分辨率的新型超分辨显微技术，该技术的关键在于对表面增强拉曼散射(SERS)的应用。

　　近年来，SIM由于其光毒性低、成像速度快、适用于观察活细胞等优点得到了越来越广泛的应用，然而传统SIM由于原理上的限制只能达到衍射极限两倍左右的成像分辨率。PSIM将SIM与可调制的SPI结合起来，用SPI序列作为新的照明光源代替传统SIM中的激光干涉条纹，利用振镜扫描实现条纹变化，通过重建达到了相当于传统SIM两倍的分辨率。

　　图1 PSIM技术下的直径为100 nm的荧光颗粒。(a)传统的荧光显微;(b)重建的PSIM图像;(c)对应的SEM图像;(d-e)a，b两图的傅里叶变换，黄色虚线代表光学传递函数。(f)蓝色的为传统荧光成像的截面强度分布，绿色和红色为PSIM重建后的两个轴向分布

　　相比之下，PSIM主要有以下优点：

　　1.高分辨率。与传统SIM技术和SSIM技术相比，PSIM的优势在于在不减帧速且不利用饱和荧光效应的前提下获得高分辨率的显微图像。

　　2.高信噪比。倏逝波在垂直方向上快速衰减,通过将激发光限制在样品表面一个很小的区域内即可得到较高的信噪比。

　　3.成像分辨率不依赖于NA。PSIM原理上不依赖于NA的限制,利用较小NA的物镜仍可获得比SIM更高分辨率的图像。

　　4.极大的应用前景。对于诸如哺乳动物细胞等需要对其表面进行观测的样品，PSIM是一种能够较好地解决衍射极限问题、同时还具备较高对比度的成像手段。这种技术将在高速超分辨领域内产生巨大的影响。

　　芯片照明超分辨

　　基于芯片的CWN，简称芯片照明超分辨，利用照明光在波导片与样品界面处产生的瞬逝场使得样品仅在表面极薄的部分得到激发，从而减弱获取信号中背景信息的干扰，实现超分辨。

　　CWN技术是由Grandin等在2006年提出的，并由Diekmann等在2017年进行改进。Diekmann等利用波导片实现了照明光与探测光的完全分离，在原有的平板波导的基础上研制了可控能力更强的肋形波导和带状波导，如图2所示,将复杂的光学功能集成在以波导片为主体的通用平台上。

　　图2 波导片a.在原有平板波导的基础上部分蚀刻可制成肋形波导;b.在原有平板波导的基础上完全蚀刻至SiO2底板可制成带状波导。两种情形下波导通道的宽度都是25-500 μm

　　CWN的主要优点有：

　　1.波导片的应用将激发光路完全从显微系统中分离出去，使用时无需考虑光路的耦合，大大降低了整套设备的复杂度;

　　2.波导片利用光在高折射率材料和周围介质(水或细胞)间的界面上发生全内反射的原理，高效地利用瞬逝场照明样品;

　　3.由于其对照明光在空间上的严格限制，图像具有较高的信噪比;

　　4.由于照明光与成像光的物镜非相关，因此可以随意根据需要更换不同放大倍数/分辨率的物镜;

　　5.由于该技术对光信号的利用效率高，使用NA较小的物镜即可在获得较大视场的同时，确保图像的分辨率不至于太差。

　　Diekmann等利用两种互补的技术———ESI技术和直接STORM(dSTORM)技术，展现了基于波导芯片的超分辨荧光显微成像技术的功能。这项技术解决了一直以来存在于超分辨显微技术中的缺陷,提高了超分辨显微系统的应用性能，有极大的市场价值和开发前景。此外，该技术为研究者提供了新的思路，基于芯片的激光产生、过滤和调制技术将为超分辨显微领域带来发展的新动力。可以预见，未来的超分辨显微领域将会因为光子集成电路的发展而再次产生较大的飞跃。

　　偏振超分辨成像技术

　　荧光的基本物理尺寸包括强度(反映荧光浓度)、波长(吸收和发射光谱)、时间(荧光衰减寿命)和偏振(由偶极子取向产生)。想比于其他三个维度，偏振在超分辨领域的发展仍处于初级阶段。

　　2014年，Walla课题组提出了偏振调制超分辨(SPoD)技术。该技术在不需要结构光照明、开关调制以及闪烁荧光探针的条件下通过偏振调制以及偏振角度缩小实现了超分辨成像，将偏振引入超分辨显微成像领域。偏振调制数据采用SPEED反卷积算法进行解调，从而重构超分辨图像。该方法虽然可以实现超分辨，但重构期间会导致偶极子方向信息丢失。

　　2016年10月31日，北京大学课题组及其合作者提出了一种新的基于偏振偶极子方位角的SDOM技术。该技术利用稀疏增强反卷积算法代替了SPEED算法，同时从荧光强度和荧光各向异性等方面来考虑偏振调制能否带来更多超分辨信息，完美回答了上述争论问题，并在实现相同强度分辨率的条件下进一步获取了偶极子取向信息。

　　另一种偏振超分辨技术主要基于单分子成像。Cruz等提出的偏振解析dSTORM(polar-dSTORM)可在一帧中测量单个荧光偶极子，并通过随机切换开/关状态在其他帧中测量其他的偶极子取向，再通过重建获得整体的超分辨率图像。在polar-dSTORM中，为了保持单分子定位中的高信噪比，使用两个探测通道来实现平面取向内偶极子取向信息的测量，并忽略单个偶极子的摆动信息。通过重建算法计算每帧中单个分子的方位角和位置，可以实现单分子的准确定位和取向测量。

　　相比于其他超分辨技术，利用偏振实现超分辨的优势在于：在不牺牲成像速度和样品毒性的前提下获取样品的超分辨信息;可在不影响原系统性能的条件下很容易与现有的成像系统相结合使用。因此，未来荧光偏振超分辨显微镜可在更多的生物领域中发挥作用。

　　还有一种不依赖于光学技术来突破衍射极限的方法，该方法是在衍射极限存在的条件下人为地放大生物样品，从而观察到更细微的结构信息。这便是我们接下来要讲述的利用化学方法将样品物理放大的膨胀样品超分辨成像技术。

　　膨胀样品超分辨成像技术

　　膨胀样品显微术(ExM)的概念是由Chen等于2015年提出的，该技术利用高吸水性分子吸水溶胀的特性，将样品物理放大以达到超分辨显微的效果。这种高吸水性分子最常见的用途之一就是婴儿尿布。我们知道在吹气球的时候，气球吹得越大，气球的厚度越薄，也就是说，我们想要让样本放得更大，就需要减少细胞中那个由高吸水性分子形成的网的密度，如此一来最大的问题便是细胞在溶胀过程中无法各向同性的扩大，会导致细胞结构变得极其不稳定，也就没有了观察的意义。

　　如何将一个样品在高度放大的同时保留其原有结构呢?

　　研究人员通过努力找到一种方法使得细胞在溶胀的过程中还可以保持其结构的稳定，而这种方法便是采用另一种高吸水性分子凝胶。在样本随着吸水分子的膨胀倍增之后，让凝胶去破坏原有吸水分子间的交联以保持样品结构的稳定，随后再次让样本膨胀，进一步放大它的尺寸。如此一来，样本可放大到20倍左右，分辨率达到25 nm。

　　ExM便宜、快速且分辨率高，在超分辨显微成像中已是一个巨大的突破，可实现常规超分辨光学显微镜可达到的效果。相比于传统显微镜，ExM的时间分辨率无附加限制，但空间分辨率可以达到25 nm。相比于原有超分辨技术，其样品制备要求与传统显微镜相同,因而适用范围较广。

　　表 几种新型成像方法对比

　　上述几种新型的超分辨技术在不同的应用中各有所长，为光学成像领域带来了新的曙光。随着人们对生命科学领域的不断深入探索，超分辨技术将会继续发展以满足不同的应用需求。