实验原理

从细胞或组织中得到RNA是一种混合物，其中包括tRNA，rRNA和mRNA，其中RNA为75%～ 85%，tRNA占10%～16%，而mRNA仅占1%～5%，并且mRNA基因序列不同，分子量大小不均一，各基因的表达丰度也不一样。每克细胞可分离出5-10mg RNA。

真核生物mRNA具有5’端帽子结构(m7G)和3’端的poly(A)尾巴。绝大多数哺乳动物细胞的3’端存在20-300个腺苷酸组成的poly(A)尾，这种结构为真核mRNA分子的分离和纯化，提供了极为方便的条件，寡聚(dT)纤维素或寡聚(U)琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的实验理论就在于此。

一般mRNA分离纯化的原理就是根据mRNA 3’端含有poly(A)尾巴结构特性设计的。当总RNA流经寡聚(dT)(即oligo(dT))纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异地吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过oligo(dT)纤维素柱吸附和解吸附，即可得到较纯的mRNA。

实验材料

1、0.1mol/L NaOH (用0.1% DEPC处理过的无RNase水配置)

2、寡聚Oligo(dT)-纤维素

3、加样/洗涤缓冲液1：0.5 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每组250mL或0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 1mmol/L EDTA(pH8.0), 0.1% SDS。(用0.1% DEPC处理过的无RNase水配置)

4、洗涤缓冲液2：0.1 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每组250mL或10mmol/L Tris-HCl (pH7.6), 1mmol/L EDTA (pH8.0), 0.05% SDS。(用0.1% DEPC处理过的无RNase水配置)

5、5 mol/L NaCl(加0.1% DEPC处理过夜)

6、3 mol/L NaAc pH5.2(加0.1% DEPC处理过夜)

7、无RNase双蒸水(DEPC水)

8、70%乙醇(用0.1% DEPC处理过的无RNase水配置)

需要用到的实验仪器：恒温水浴箱，高速冷冻离心机，紫外分光光度计，巴斯德吸管，玻璃棉，5ml一次性注射器。

实验过程

(一) oligo(dT)纤维素的预处理

1、用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。

2、将悬浮液装入填有经DEPC水处理，高压灭菌后的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床约0.5-1.0mL，用3倍柱床体积的无RNase的灭菌双蒸水冲洗oligo(dT)纤维素。

3、用3-5倍柱床洗涤缓冲液I冲洗oligo(dT)纤维素，直到流出液的pH值小于8.0。

4、将处理好的oligo(dT)纤维素从巴斯德吸管倒出，用适当的柱床洗涤缓冲液I悬浮，浓度约为0.1g/mL，保存在4℃待用。

(二) 总RNA浓度的调整

1、把总RNA液转到适合的无RNase离心管中，测定总RNA的浓度。如果总RNA的浓度大于0.55mg/mL，则用无RNase的双蒸水稀释至0.55mg/mL，总RNA的浓度对除去rRNA是很重要的。浓度调整以后，把RNA溶液置于65℃水浴加热5 min，然后迅速插在冰上冷却。

2、加入一定体积5 mol/L NaCl使RNA溶液中盐的浓度调至0.5 mol/L。

(三) mRNA的分离

1、mRNA与Oligo(dT)-纤维素结合：用移液器重新悬浮oligo(dT)-纤维素，取适量的oligo(dT)-纤维素到RNA样品中，盖上盖子，颠倒数次将oligo(dT)-纤维素与RNA混匀。于37℃水浴保温并温和摇荡15min。oligo(dT)-纤维素与RNA所需量如下表。

表1 总RNA量所需材料的体积

2、转移：取1个5ml注射器，用经过高温灭菌的玻璃棉塞紧注射器前端，注射器固定在无RNase的支架上，把oligo(dT)-纤维素/RNA悬浮液加入注射器中，把塞子推到底部，收集流出的液体，即把含有未结合上的RNA液体收集到无RNase的离心管中(保留至确定获得足够的mRNA)。

3、洗涤：根据表1所需洗涤缓冲液1的体积，直接用注射器慢慢吸取，温和振荡，充分悬浮mRNA-oligo(dT)-纤维素，推动塞子，用无RNase的离心管收集洗出液。测定每一管的OD260，当洗出液中OD值为0时准备洗脱。

4、洗脱：根据表1所需洗脱液体积，用注射器慢慢吸取洗脱缓冲液2或无RNase双蒸水到注射器内，充分重悬mRNA-oligo(dT)-纤维素，推动塞子，以1/3至1/2柱床体积分装到无RNase的离心管中。

5、测定每一管的OD260，合并含有RNA的洗脱液。在4℃条件下，2500g，离心2-3min，将上清转移至新无RNase的离心管中。

6、沉淀：向上清液中加入1/10体积的3mol/L NaAc (pH5.2), 再加入2.5倍体积的冰冷乙醇，混匀后，-20℃条件下沉淀30min或放置过夜。

7、离心收集：4℃条件下，12000g, 离心15min，小心弃去上清，用70%乙醇漂洗沉淀，4℃条件下，12000g, 离心5 min，小心弃去上清液。沉淀空气干燥10min。将mRNA沉淀溶于适当体积的无RNase的双蒸水，立即用于后续实验，或用70%乙醇溶解，贮存于-70℃。

8、定量：测定OD260和OD280，计算产率以及OD260/OD280的比率

注意事项

1、整个操作过程必须严格遵守无RNase操作环境，且注意操作中的低温要求。

2、用于纯化的总RNA样品须尽量保持RNA完整，不能被降解，获得完整mRNA质量的前提条件。

3、总RNA与Oligo(dT)-纤维素的比例要适当，若总RNA会影响mRNA纯度。

4、RNA溶液与Oligo(dT)-纤维素结合前必须置于65℃加热5min，其作用：(1)破坏mRNA的二级结构，特别是poly(A+)尾处的二级结构，使poly(A+)尾充分暴露，提高poly(A+)RNA回收率;(2)解离mRNA与rRNA的结合。加热后应立即插入冰上，以免由于温度的缓慢下降使mRNA又恢复其二级结构。

5、应注意mRNA不能被DNA污染，否则严重影响实验结果。

6、mRNA制备后，可用变性琼脂糖凝胶电泳捡测其完整性和有无DNA污染。提取的mRNA应该在0.5~8.0kb之间呈现弥散状，无明显区带，但大部分的mRNA应在1-2.0kb范围内呈弥散状。经过一次纯化分离的mRNA还会有微量的rRNA残留，但一般来说不会对后续实验造成很大的影响，如果样品纯化后量足够，可将经过一次纯化分离的mRNA再纯化一次，进一步提高其纯度。

7、为防止mRNA降解，应避免多次冻融，可将mRNA少量分装后保存。 也可将mRNA用70%乙醇溶解，在-70℃保存，保存时间在一年以上。

8、Oligo(dT)-纤维素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入0.02%叠氮钠(NaN3)，放在4℃冰箱保存。经过预处理后可以重复使用。