LC-MS/MS对生物素标签的可检测性
生物素标签
LC-MS/MS
生物素是蛋白质组学工作流程中经常使用的亲和标签，通过研究这两种生物素标签，找出最佳的液相色谱和质谱仪配置，准确完整地鉴定了生物素化的肽。
生物素与链霉亲和素具有稳定的非共价相互作用，可应用于蛋白质定位、合成和相互作用检测上。通常，基于生物素标记的方法会采用间接鉴定方法。直到最近，研究发现直接检测生物素化位点更加精准，提供信息更多，直接检测法才逐渐流行起来。但目前生物素化对色谱、电离以及质谱检测的影响仍未完全清楚，直接检测法尚未完善。
本文中，作者团队研究了两种常用的商业生物素标签EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin(biotin-NHS)和Sulfo-NHS-SS-Biotin(biotin-SS-NHS)，其中biotin-SS-NHS具有较长的接头，其中包括二硫键，可在还原条件下释放结合的蛋白质，便于在富集后检测生物素化肽。
首先，为了检验生物素化效率，该团队使用胺反应性荧光剂来测定肽中游离氨基的相对数目。由于生物素化肽段的N末端或赖氨酸残基上的伯胺与生物素标记NHS酯部分生成了酰胺键，无法与荧光剂反应，因此可以借此检测出生物素化效率。结果发现两种生物素化试剂均能有效标记样品中的氨基，观察到的标记效率大于90％(图1A)。
接着，作者通过LC-MS/MS检查了生物素化肽，观察到两种生物素标记的总肽段鉴定数量相近(图1B)。但是，在biotin-SS-NHS样品中88％的肽被生物素化，而在biotin-NHS样品中仅有76％的生物素化肽。此外还发现，样品中的biotin-SS-NHS主要有未还原、还原和烷基化三种形式。
为了确定烷基化条件对标记反应是否有抑制作用，作者团队还检测了半胱氨酸残基的还原度和烷基化效率。发现所有样品中半胱氨酸残基的氨基甲酰甲基修饰率均≥98％(图1C)，进一步发现，biotin-SS-NHS样品中24％的完全生物素化的肽以多种形式出现(图1D和E)，表明在与半胱氨酸残基相同的还原烷基化反应条件下，biotin-SS-NHS标签不容易被烷基化。因此，作者团队决定继续使用biotin-NHS标签进行研究，以减少研究复杂性。
图1.biotin-NHS和biotin-SS-NHS肽之间的比较。(A)使用荧光肽测定生物素标记效率(空白，biotin-NHS和未标记组重复次数n=5;biotin-SS-NHS重复次数n=4)。(B)LC-MS/MS过程中biotin-NHS和biotin-SS-NHS样品的肽段鉴定比较(重复次数n=5)。(C)半胱氨酸残基的氨基甲酰甲基修饰(重复次数n=5)。(D)biotin-SS-NHS样品中的生物素化模式。(E)biotin-NHS，biotin-SS-NHS和未标记样品中相同肽的代表性质谱图。
作者团队进一步检测质谱对生物素化肽的检测效率，并将其与质谱对未标记的胰蛋白酶肽的检测效率相比较，发现检测到的生物素-NHS标记的肽少于未标记的肽(图2A)。但这种差异不能归因于碎片离子的覆盖率(图2B)。并且还发现，虽然检测到的生物素化肽较少，但这些肽的强度与未标记肽的强度相当(图2C)。
为了找出生物素化肽检测率低的原因，该团队首先检查了肽的保留时间，发现生物素化的肽可能会较晚洗脱(图2D)，并且生物素化的肽平均长12个氨基酸，而未标记的肽平均长14个氨基酸(图2E)。接着又对N末端残基进行检查，发现与未标记的肽相比，生物素化的肽N端精氨酸、组氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺和丙氨酸(图2F)的比例增加。作者推测生物素化样品中甘氨酸和丙氨酸的高含量与它们的立体结构有关。甘氨酸具有最小的侧链，而丙氨酸具有最小的疏水性侧链，因此伯胺更易接近它们的侧链进行反应。
至于组氨酸和精氨酸的高表达，作者推测可能与这些氨基酸的侧链对肽的总电荷的影响有关。质谱仪采集数据依赖于N端的正电荷以及胰蛋白酶消化产生的C端赖氨酸或精氨酸残基。并且一般的质谱设置排除了不带电荷或带单电荷的实体以进行进一步分析，而生物素标记会与N末端和赖氨酸侧链中的伯胺发生反应，减少肽的总正电荷。这可能降低了生物素化肽检测率。
为了进一步验证，作者团队检查了C末端残基，结果发现53％未标记肽具有C端赖氨酸，46％具有C端精氨酸；50％生物素化肽具有C端赖氨酸，49％具有C端精氨酸(图2G)。完全生物素化的肽则几乎没有C端精氨酸，仅有10％具有C端赖氨酸。C端残基比例的变化进一步支持了生物素化肽会丢失正电荷的假设，说明生物素标记将影响检测。
图2.biotin-NHS肽与未标记肽之间的比较。(A)biotin-NHS样品和未标记样品之间的肽段鉴定比较(重复次数n=5)。(B)biotin-NHS(蓝色)和未标记(灰色)样品中b和y碎片离子的序列覆盖率(重复次数n=5)。(C)生物素化样品(上图)和未标记样品(下图)中肽强度的分布。(D)比较在生物素化肽和未标记肽中观察到的保留时间(重复次数n=5)。(E)比较在生物素化的(蓝色)肽和未标记的(灰色)肽中观察到的肽长度(重复次数n=5)。(F)比较生物素化和未标记肽段N端氨基酸的频率(重复次数n=5)。FC是N蛋白末端观察到的氨基酸频率与预期的氨基酸频率之间的比率。(G)比较生物素化和未标记肽的C末端位置的氨基酸频率(重复次数n=5)。
由于生物素化明显影响了LC-MS/MS分析过程中的检测，作者试图确定是否可以通过其他干预措施来改善。作者推测生物素化消除电荷同时将产生带更多电荷的肽前体，并且在片段化设置中选择包含单电荷前体后，检测到的生物素化肽的增加将超过与非肽类污染物片段化相关的损失。改变MS设置后，生物素化和未标记样品中单电荷肽的数量均增加。并且当分析包括单电荷前体后，生物素化肽的鉴定平均增加了21％(图3A和B)。
此外，单电荷肽的保留时间在整个梯度中分布更均匀，而电荷较高的前体偏向梯度的疏水端（图3C）。由于单电荷的肽在标准梯度上分离效果更好，进入液相色谱后，鉴定效率进一步增强，并检测到双电荷和三电荷带电肽分别平均下降了9％和3％(图3D)。对单电荷肽的深入分析表明，这些肽中的大多数在N端被生物素化(图3E)。总体而言，生物素化肽段鉴定的净收益为21％，这证明了单电荷肽段的收益大于较高电荷态的损失。因此，可以通过增加对单电荷肽的检测可以优化生物素化肽检测方法。
图3.生物素化肽检测的优化。(A)将肽鉴定与单电荷肽的包含和排除进行比较(重复次数n=5)。(B)在生物素化(蓝色)和未标记样品(灰色)中包含单电荷的肽后，肽鉴定数量增加。(C)检测的代表性洗脱曲线与单电荷肽的包含和排除之间的比较。线图代表在特定保留时间洗脱的肽数。(D)在包含或排除单电荷肽的情况下检测到的肽的电荷分布。(E)带有或排除带有单电荷的肽的带单电荷的肽的生物素化。
总而言之，本文作者团队的工作表明，生物素-NSH标记物与肽的连接会影响LC-MS/MS对肽的检测，为高生物素化肽的低识别率提供了可能的解释，并指出了增加对单电荷肽的检测的缓解策略，且进一步证明了生物素化肽的保留时间发生了变化，表明需要优化液相色谱梯度。
本文发表在J.Proteome Res.上的文章，Detectability of Biotin Tags by LC–MS/MS[1]。该文章的通讯作者是来自加拿大温哥华哥伦比亚大学的Philipp F. Lange博士。
[1]Nierves L, Lange PF. Detectability of Biotin Tags by LC-MS/MS. J Proteome Res. 2021 Mar 29. doi:10.1021/acs.jproteome.0c01049. Epub ahead of print. PMID:33780260.
李惠琳课题组
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