微量蛋白质组学的进展竟然这么大？！

赵敏 0 2021-05-14

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单细胞生物学是近年非常热门的话题了，既然单细胞生物学这么热门，单细胞的蛋白质组什么时候可以开展？早在2018年就有了一套用于痕量样本的前处理装置nanoPOTS，该装置可将样本的反应体积由传统的数百微升降低至200纳升。今天小析姐就和大家聊一聊微量蛋白质组学的技术原理及前处理装置nanoPOTS的使用情况。

世界上没有两片相同的树叶，对于多细胞的生物，细胞和细胞之间也存在很大的差异，这也就是为什么要开展单细胞组学了。 2020年发表在顶级期刊的MCP（Mol Cell Proteomics）的综述：单细胞蛋白质组学进展与展望中。

文章从样品制备、到质谱仪、方法学都有突破和进展（后续质谱线的小编会详细介绍），其实单细胞的蛋白质组学从开始到成熟还是要有一段路要走的，但是并不意味着我们现在什么也做不了。

微量蛋白质组学应用场景和优势

Part1样品的细胞量少的阻碍我的SCI的发表

1、我的实验流式分选就这么多细胞了（还不到一万个），我想看看有哪些蛋白表达。

2、我的课题是原代细胞，样品非常珍贵，给不了你们蛋白质组学的最低量等等，基本上就是样品珍贵、样品分选少、反正细胞样品少少少。

Part2 常规细胞样品准备起来轻松简单，再也不担心没时间看文献了

听说细胞样品少，就可以做微量蛋白质组学了，终于准备样品不仅节省时间也节省力气，又可以多看些文献构思我的SCI论文了。

Part3 文章新颖增色不少，只有你想不到没有我们做不到

1、植物的原生质体（联川已经开启植物单细胞原生质体的制备时代）微量蛋白质组学。

2、分选细胞的samrt-seq 和微量蛋白质组学的研究思路。

3、结合分选细胞进行10X单细胞测序和微量蛋白质组学的文章设计等等。

优势基本就是：样本量低、成本可控（降低取样成本）、技术原理（芯片操作）避免污染、文章新颖配合当红的10X单细胞、smart-seq等等定会为文章的发表增色不少。（当然目前只接收细胞样品哦！）

微量蛋白质组学的技术原理简介

2018年Nature Communications在线发表“Nanodroplet processing platform for deep and quantitative proteome profiling of 10-100 mammalian cells”的研究论文，是由美国华盛顿州国家环境分子科学实验室的Ryan T. Kelly团队最新研究成果，基于质谱(MS)的蛋白质组学方法大部分需要包含至少数千个细胞的样本来提供深入的分析，课题采用了基于芯片的纳升级微量液滴蛋白处理系统nanoPOTS，该平台nanoPOTS (nanodroplet processing in one pot for trace samples) 可以基于小细胞群体进行蛋白质组学的分析，nanoPOTS可将处理量降低至200nL以下，减少表面损失，提高了样品的效率和回收率；与超灵敏的液相色谱质谱联用仪相结合时，nanoPOTS可以从10-140个细胞中鉴定到约1500-3000个蛋白。

接下来让我们看看该平台如何巧妙的进行样品的制备及分析性能测试：

该装置中，样本的提取和酶解均在玻璃板（nanoPOTS glass chip）上进行。该chip可按图1所示进行制作。利用光蚀刻技术在玻璃板一侧雕刻凹槽，凹槽做疏水处理，而凹槽中央突起部分（nanowell）的表面经亲水处理后，作为生物样本的前处理表面。

图1 NanoPOTS glass chips的制作过程，在nanowell上进行样本的处理

玻璃板处理完毕后，加盖密封膜以及盖玻片，减少样品挥发，然后整合至nanoPOTS进行样品处理。图2为该系统的工作流程。首先加样至nanowell上，在显微镜下细胞计数或确认组织取样状况。随后加入RapiGest试剂和DTT，于70 ℃孵育，实现细胞裂解，蛋白提取、变性及还原。经碘乙酰胺烷基化后，蛋白由Lys-C和Trypsin两种蛋白酶顺序酶解，之后将溶液酸化并失活RapiGest试剂终止酶解。最后将酶解得到的多肽吸取至毛细管，其后连接固相萃取预柱进行除盐，除盐后直接将预柱与液相色谱系统的色谱柱连接，进行梯度洗脱和质谱鉴定，减少转移和吸取样品造成的损失。

图2 NanoPOTS工作流程图

利用该装置，作者对HeLa细胞进行了蛋白质组学分析。在初始细胞数为10–14, 37–45以及 137–141（图3a）时，平均鉴定的多肽数目为7364 至17836（图3c），蛋白数目为1517至3056（图3d）。结合软件MaxQuant的Match Between Runs (MBR)算法，能将蛋白鉴定数目提高至3092, 3215和3460（图3d）。

图3 不同HeLa细胞数目的蛋白鉴定情况

同时作者将该方法与常规样本处理的鉴定结果进行对比。在25 μL的反应体系下，10~140个细胞中，最终鉴定的蛋白数目为313至2048（图3 f），与nanoPOTS的蛋白鉴定数目有较大差距。并且，初始样本量越少，蛋白鉴定数目差距越大（图3 d，f）。结果表明在超微量样本分析时，nanoPOTS能够获得更好的鉴定效果。

在定量方面，该方法能够从10-14个细胞中定量13194条多肽和2674种蛋白。任意两个样本间的多肽定量线性相关系数R²在0.91~0.94，蛋白定量的线性相关系数R²在0.98~ 0.99之间（图4a-c）。并且蛋白定量的CV中位值均小于20%（图4 d）。可定量的蛋白丰度范围在4个数量级以上。表明该方法可以获得较为可靠的定量结果。

图4 不同数目HeLa细胞的定量重复性

作者进一步将该方法应用于组织病理切片的分析。采用LCM（激光捕获显微切割）方式获取胰腺组织切片上的单个胰岛，对1型糖尿病（T1D）和健康对照组各9例样本进行分析（图5 a）。各胰岛间蛋白定量的线性相关系数R²在0.93至0.97之间（图5 b），而且该方法能够区分多种与T1D相关的差异蛋白质（图5 c），该实验扩展了nanoPOTS的适用范围。