为向玻璃管中填入固定相，以流动相溶剂浸润后在上方倒入待分离的溶液，再滴加流动相，因为待分离物质对固定相的吸附力不同，吸附力大的固着不动或移动缓慢，吸附力小的被流动相溶剂洗下来随流动相向下流动，从而实现分离。

以滤纸条为固定相，在纸条上点上待分离的混合溶液的样点，将纸条下端浸入流动相溶剂中悬挂，溶剂因为毛细作用沿滤纸条上升，样点中的溶质从而被分离。

是在玻璃板上涂以固定相涂层，然后点样，下端浸入溶剂，同样自下而上分离。常用于探索柱色谱实验条件，溶剂和固定相的选择等。

常用固定相有石膏、氧化铝、蔗糖、淀粉等，常用流动相为水、苯等各种有机溶剂。

1.流动相pH

不同基质的填料具有不同的pH适用范围。常温下无定形硅胶在纯水中的溶解度约为100mg·L-1，且在pH 1～9的范围内溶解的硅胶量几乎是常量，考虑到溶解速度的影响,对于硅胶基质的填料,其所能承受的流动相pH范围约为1～8。键合相硅胶填料则由于键合层的屏蔽作用,使填料对流动相的适应范围大大增加，如现在广泛使用的反相色谱填料C18 (十八烷基硅烷键合硅胶)，其pH适用范围可达2～10。当流动相pH值超出酸性范围时，键合相易发生水解而流失；当流动相pH超出碱性范围时，会加速硅胶的溶解而释放出絮状物堵塞柱子，这两种反应均是不可逆反应，特别是在温度较高（>40℃）的环境下，会使柱效迅速降低而报废。

2.流动相变质

当前使用最为广泛的是硅基键合相填料，当以水溶液作为流动相或流动相中含有一定浓度的磷酸盐缓冲液时，水溶液中或缓冲盐溶液中会滋生出一些细菌或霉菌，从而堵塞固定相颗粒间的空隙。特别是对于多元自动比例混合的高效液相色谱仪来说,水相或缓冲盐相独立存贮，因存放时间较长而容易发生此类问题。

3.流动相纯度　

目前，广泛使用的填料颗粒粒径范围在3～10μm,孔径在6～10nm,色谱柱在使用中会有大量的流动相通过,如流动相含有微量不溶性杂质颗粒,则很容易在柱头部位被截留,久而久之,造成色谱柱机械性堵塞,引起柱压升高而无法正常使用。

4.其它因素

如，流动相的极性对柱子也有一定影响，甲醇、水、冰醋酸等极性较大的物质会破坏硅胶填料柱，正丁醇、二氯甲烷等极性小的物质会破坏化学键合硅胶柱，碱性溶液会破坏阳离子交换树脂色谱柱,酸性溶液容易损坏阴离子交换树脂柱。

1.样品的溶解性　

样品试样在配制中，如有少量微粒未能完全溶解，则会随试样一起进入色谱柱，同样，会沉积在柱头处，造成色谱柱的堵塞。

2.样品的纯度　

样品中可能含有待分析组分以外的各种组分或杂质，这些组分或杂质可能会在柱内产生不可逆吸附，从而，使固定相的活性点被覆盖，保留特性发生变化。

3.样品的化学性质

待测试样中的各种组分与填料之间应具有化学稳定性，比较典型的是在使用氨基键合柱时，应避免使用含羰基的化合物和流动相，如，丙酮、乙酸乙酯等，以免固定相中的NH2和酐、酮发发希夫(Schiff)缩合而使固定相破坏。

影响色谱柱寿命的因素很多，除流动相和样品因素外，还有其它一些外在因素，如，柱压的影响，温度的影响，色谱柱的正确冲洗，色谱柱的正确安装等。

色谱柱在使用中最常见的问题就是柱压升高，如果柱压是在长时间使用过程中缓慢增加，属于正常现象。但柱压在使用过程中突然升高（系统管路堵塞及压力传感器故障除外），以下列举了部分常见原因及解决办法：

1.色谱柱头的过滤筛板堵塞或污染。

解决方法：如确定是色谱柱头的过滤筛板被污染，可以将色谱柱反方向用甲醇冲洗至正常压力，或者卸下色谱柱头，将其放在10％的稀硝酸内超声清洗10分钟，后再用纯水超声10分钟，重新装入色谱柱。

2.色谱柱头的填料被样品污染。

解决方法：如确定色谱柱头的填料被污染，将柱头螺丝卸下，挖出柱内前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔细修复后，重新安装上柱头螺丝。

3.色谱柱内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或其他有机溶剂，形成结晶析出。

解决方法：如确定定是盐结晶，用10%的甲醇/水冲洗色谱柱使柱内盐全部溶解，再换高浓度甲醇。

4.流动相PH值过大或过小使固定相结构破坏或溶解。

解决方法：如果因pH值使用不当，很难恢复。

1.避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此，在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓。

2.应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。

3.一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。

4.选择使用适宜的流动相(尤其是pH)，以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。

5.经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右。

下面列举一些色谱柱的清洗溶剂及顺序，作为参考：

硅胶柱以正已烷(或庚烷)、二氯甲烷和甲醇依次冲洗，然后再以相反顺序依次冲洗，所有溶剂都必须严格脱水。

甲醇能洗去残留的强极性杂质，已烷使硅胶表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷(或氯仿)依次冲洗，再以相反顺序依次冲洗。如果下一步分析用的流动相不含缓冲液，那么可以省略最后用水冲洗这一步。

四氢呋喃与乙腈或甲醇的混合溶液能除去类脂。有时也注射二甲亚砜数次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸(0.1%)梯度洗脱能除去蛋白质污染。

阳离子交换柱可用稀酸缓冲液冲洗，阴离子交换柱可用稀碱缓冲液冲洗，除去交换性能强的盐，然后用水、甲醇、二氯甲烷(除去吸附在固定相表面的有机物)、甲醇、水依次冲洗。

6.保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。

7.色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。在后两种情况发生时，小心拧开柱接头，用洁净小钢将柱头填料取出1～2mm高度(注意把被污染填料取净)再把柱内填料整平。然后用适当溶剂湿润的固定相(与柱内相同)填满色谱柱，压平，再拧紧柱接头。这样处理后柱效能得到改善，但是很难恢复到新柱的水平。柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前装一根与分析柱相同固定相的短柱(5～30mm)，可以起到保护、延长柱寿命的作用。采用保护柱会损失一定的柱效，这是值得的。通常色谱柱寿命在正确使用时可达2年以上。以硅胶为基质的填料，只能在pH=2～9范围内使用。柱子使用一段时间后，可能有一些吸附作用强的物质保留于柱顶，特别是一些有色物质更易看清被吸着在柱顶的填料上。

8.新的色谱柱在使用一段时间后柱顶填料可能塌陷，使柱效下降，这时也可补加填料使柱效恢复。每次工作完后，最好用洗脱能力强的洗脱液冲洗，例如，ODS柱宜用甲醇冲洗至基线平衡。当采用盐缓冲溶液作流动相时，使用完后应用无盐流动相冲洗。含卤族元素(氟、氯、溴)的化合物可能会腐蚀不锈钢管道，不宜长期与之接触。装在HPLC仪上柱子如不经常使用，应每隔4～5天开机冲洗15分钟。

如果色谱柱不使用，又该如何进行保存呢？下列方法可供参考：

在柱二端包起来，放到盒子里室温避光保存。毛细管柱可以用废旧的隔垫裁成二块，分别插在毛细管二段。填充柱用小塑料袋套住，再用细金属丝扎起来。因为分析室有许多化学试剂，特别在橱内会有些气味，这样能较好保管色谱柱。放置时也要有序放置，毛细管柱还是用盒子装好以免压坏，在放置时在柱上和记录本上都做好记录。

拆下后，两头用橡胶垫密封，橡胶垫原本色谱盒子就带有，如果没有，用进样垫制作一下就可以了，然后装在原来的色谱盒子里面，备注上相应的信息。通常要求放在干燥的地方，下次使用时，切记进样端和出口端不能装反。

保护柱的作用是过滤掉来自流动相和样品的化学“拉圾”同时也可以有效除去流动相和样品中的不溶物。尽管现在的色谱仪在流动相吸入口、进样阀后部以及在色谱柱的两端都装有1、2μm等不同孔径的滤器,但滤器只能除去不溶性颗粒而不能除去化学污然,因此,加装保护柱是必要的,特别是在分析中药、中成药等复杂混合物和生物样品时更是保护分析柱必不可少的措施。

保护柱填料应与分析柱一致,粒径可较分析柱大。保护柱属消耗品,经过一定次数的样品分析(50～100次)后,出现柱压显著升高或峰形变坏或基线漂移时,应考虑更换保护柱。

流动相通常由水或缓冲溶液与有机溶剂混合而成,原则上,所有经过色谱柱的流动相均应过滤,但在实际操作上应视具体情况而有所区别:当有机溶剂用色谱纯级,水用石英亚沸水或其它超纯水时,在能确保水和有机溶剂的质量且没有受到污染时,过滤并无更多实际意义。

当流动相中含有缓冲盐时,则过滤是必要的,如前所述,当缓冲溶液放置一段时间(视环境温度不同而异,夏季一般不超过48 h,冬季一般不超过一周)后,在使用前还应重新过滤。

所配制的样品试液在注入流路系统前均要经0. 45μm（0.22μm则更好)孔径滤膜过滤。要注意区分水系和油系,二者不可混用,以防止滤膜溶解而造成污染。装流动相的容器和色谱系统中的在线滤器要定期清洗和更换,以避免滤器因过载而起不到过滤作用。

当样品中含有对色谱柱有损害的化学成分,如产生永久性吸附的蛋白质、糖等有机分子和强吸附性物质,以及可能对柱填料产生破坏作用的基团离子。在进样前应尽可能对样品进行分离提纯以除去多余杂质组分。

虽然高效液相色谱柱能耐受的压力可达6000psi(磅/平方英寸) ,但过高及过大的压力变化均会缩短色谱柱的寿命,避免的方法是：

(1) 柱压过高时,尽可能采用较小的流速,以不超过柱最大允许压力的一半为宜。

(2) 当流速较大时,应采取流速梯度的办法使流速分步到位。

(3) 使用手动进样阀时,进样阀的切换要尽可能的快。否则

超过20%的压力冲击会很快使柱报废。当使用多柱联用时,柱切换要避免在高压下进行。

一般以硅胶为基质的色谱柱最高使用温度不超过60℃，以低于40℃为宜，特别是在流动相pH接近使用限度时，更应降低使用温度。温度过高会加快键合相的水解和硅胶的溶解，从而，使填料性质改变，柱床塌陷，降低柱效，改变峰形。目前的键合硅胶色谱柱标示的pH适用范围可达2～10,但在实际使用时应避免极端的pH条件,特别是在偏碱性的条件(pH≥8)下使用,如必须要在极端的pH条件下使用时,可通过以下方法避免柱损害:

（1）在泵和进样阀之间加装预柱(饱和柱)来饱和流动相；

（2）降低使用温度；

（3）检验完毕后立即用与所使用的流动相互相混溶的“温和溶剂”彻底清洗。

开始试验前，应了解柱中当前是何种溶剂。对于新色谱柱,如无特殊说明均为评价报告中所用流动相。柱中当前溶剂一定要与分析样品所用流动相互溶,如不能混溶,要用与二者均能相互混溶的第三种溶剂过渡。异丙醇是唯一能与各种溶剂混溶的试剂，可作为中介流动相使用。反相键合硅胶柱适宜的保存环境是纯甲醇,如分析用流动相为缓冲液2有机溶剂,可先用较低甲醇含量(<20%)的甲醇2水置换掉原来的纯甲醇,再进分析用流动相，以防止在柱内发生盐的沉淀；

试验结束后,要及时用适当的溶剂冲洗系统并最终过渡到纯甲醇冲洗,对于含有缓冲盐的流动相，最好的办法是先用与分析用流动相组成完全相同但不含缓冲盐的溶液进行冲洗，再逐步过渡到纯甲醇冲洗。多数报道冲洗液体积大约为柱容积的15～20倍,但最终要以基线是否平直、压力是否稳定决定。有些厂家的色谱柱标明了流动相中有机相的最低使用浓度为≥5% ，使用时应给予注意。