扫描电镜样品制备及图片赏析

展源 0 2023-11-21

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扫描电镜样品制备及图片赏析

扫描电镜是观察样品微观形貌的重要工具之一，样品一般在真空状态下观察，样本制备的好坏直接影响观察效果。扫描电镜对样品有哪些要求呢？不同种类样品该如何制样呢？本文将从扫描电镜的原理、成像特点及样本制备技术等方面给大家做以总结。

扫描电镜成像原理

以聚焦的电子束轰击样本表面，当电子束击中样本表面某一点时，会激发出次级电子，检测器收集这些次级电子形成相应的信号，信号经放大后被传送到显示屏，从而成像。

图1 扫描电镜成像

扫描电镜成像特点

相较于传统的光学显微镜和透射电镜，扫描电镜具有以下特点¹：

直接多角度观察样品的表面结构；
不需要将样品切成薄片；
景深大、图像立体感强；
放大倍数从几十倍到几十万倍连续可调；
电子束能量较低，对样品的损伤小；
在观察形貌的同时可以对微区的成分进行定量和定性分析。

扫描电镜对样品的要求

样品具有导电性

对于扫描电镜，入射电子的电流等于背散射电子（BSE）电流、二次电子（SE）电流和样品吸收电流的和。对于导电性好的样品，吸收电子流能够被样品顺利导走。对于不导电或导电性不好的样品，多余的电荷无法导走，样品会因吸收电子而带负电，从而产生一个静电场排斥入射电子、并偏转二次电子，造成图像畸变或不规则移动，这就是荷电现象²。荷电会对图像产生一系列影响，如图像异常反差、图像畸变、图像漂移、亮点与亮线以及立体感缺失等。

图2 样品荷电机理示意图³图3荷电现象

解决方案：

目前最为常见的减轻荷电现象的方法是通过离子溅射或者蒸镀的方法在样品表面沉积或镀上一层比较均匀、细腻的金属层，从而增强样品的导电性。另外可以通过调整观察参数减少荷电现象²：

①采用低加速电压;

②提高工作距离;

③使用下探头进行信号收集;

④在SE信号中掺入一定比例的BSE信号;

⑤缩短图像采集时间或采用 FAST 模式进行图像采集;

⑥降低发射电流;

⑦采用减速模式进行观察。

样品必须干燥，不含水分或挥发性物质

样品要尽可能干燥，电子束在真空状态下运行，若样品中含有水分，水分挥发会造成图像漂移，损伤光阑和降低灯丝寿命等。

干燥方法^4,5：

①自然干燥法：使样品中的水分或脱水剂在大气中自然蒸发干燥，适用于花粉、孢子和骨骼等；

②真空干燥法：在真空干燥仪中，抽低真空，使样品干燥，效果与自然干燥类似；

③冷冻干燥法：超低温冷冻干燥，然后真空升华；

④临界点干燥法：适用于组织样品，在临界状态（零表面应力）下使样品干燥，减少样品形变。

样品表面要清洁，不能含有污染物

污染物或其分解物会污染镜筒并遮盖样品细节。样品在制作和拿取过程中要保持清洁干净，避免手印、汗液、唾液和微量油脂污染。因此在制样过程中要佩戴干净无粉手套，使用的剪刀、镊子也要保持清洁。

热稳定性好

避免在电子束作用下样品分解，释放出气体或其他物质，污染镜筒。

形貌形态耐真空

生物样本含水量高，质地柔软，机械强度小；组成元素的原子序数低，导电性差，激发后二次电子的产额较少。

解决方法：

通过固定保存生物样品的固有形态，生物样品的含水量一般为70％～80%，因此生物样品制备的关键步骤是干燥，应尽量减少因水分蒸发导致的形变，通过梯度脱水去除水分，通过临界点干燥防止形变。在样品表面喷镀一层金属膜，改善样品的导电性，提高二次电子的数量，改善图片质量。

样品不能有磁性

磁性材料必须退磁，避免磁性材料磁场对电子束的干扰。

扫描电镜样品制备

制样的任务是通过一系列处理，尽量完美的保存样品的固有形态，同时需改变其物理特性，使其适合在电镜下观察。样品制备的好坏直接关系到电子显微图像的观察效果和对图像的正确解释。根据样品的种类、形状和导电性等差异，不同种类的样品采用不用的制备方法。

生物样品

取材

暴露要观察的最佳观察面；

注意事项：

①迅速准确，取材动作要快，部位要准；

②动作轻巧，保护好拟观察面，解剖器械要锋利，避免挤压牵拉组织，造成人为损伤；

③厚度要小，满足观察的最小体积，厚度为＜2mm；

④样品纯净，避免污染；

⑤悬浮溶液浓度要合适，过浓会造成样品堆积，过稀又造成观察困难。

清洗

用生理盐水或磷酸盐缓冲液清洗去除表面的附着物、黏液和杂质，获得清洁的观察表面；组织和清洗液为1:20体积比轻摇清洗。对于游离细胞、微生物采用离心清洗法。

固定

用2.5%戊二醛和1%锇酸固定，保存组织细胞结构，增加样品的导电性；

脱水

30%-50%-70%-80%-90%-100%酒精或丙酮梯度脱水，置换组织中的水分；脱水时间根据样品大小和性质调整。

干燥

去除样品中残存的液体，使样品中不含液态物质的过程。液态物质脱离样品表面时必须克服表面张力，其反作用力会使样品表面结构发生形变。常用临界点干燥法，在临界状态（零表面应力）下使样品干燥，减少样品形变。

粘样

将样品用导电胶粘到样品座上，保证样品在样品座上的稳定性，增强样品与样品座之间的导电性，避免观察时产生荷电现象。

镀膜

改善生物样品的导电性，提高二次电子的产额，改善图片成像质量并增加样品的机械强度。

图4 制样流程图

材料样品

块状样品

对于导电的块状样品，要求大小适合样品座尺寸，用导电胶粘在样品座上即可。对于块状非导电样品或者导电性差的样品，则需要先在其表面镀膜，增加样品的导电性，并可以防止样品的热损伤。

注意：

①如果样品表面有油污、粉尘等污染物，要用洗涤剂和有机溶剂进行超声清洗，以免影响分析结果和污染样品室。

②用导电银胶粘样品时，必须等银浆干了，如果银浆没干透，在抽真空时会不断挥发出气体，影响抽真空的速度。

粉末样品

先在样品座上粘一层导电胶，然后将粉末均匀撒在导电胶上，并用洗耳球吹去未粘牢的粉末。也可以将粉末溶解在合适的分散剂中（常用的分散剂有乙醇、丙酮、水和0.1%SDS），超声分散后，用吸管或移液枪滴加到硅片或者铜网上，烘干或晾干。导电类粉末可以直接进行扫描电镜观察，不导电的粉末样品需喷金导电处理后进行观察。