透射/扫描电镜在牙本质胶原纤维矿化表征中的应用

展源 2023-12-27

胶原蛋白是细胞外基质中最丰富的纤维蛋白，其生物活性能够调节细胞的生物学行为，具有刺激原生组织修复的潜力。

优化的胶原蛋白支架构建的仿生微环境能维持再生组织的结构完整性，从而对细胞行为与组织修复有重要影响，因此被广泛应用在骨再生/软骨再生、皮肤组织再生、心血管修复等各个领域（图1）。

图1 胶原蛋白应用示意图¹

天然骨组织的生物矿化是以I型胶原纤维为模版，羟基磷灰石在此模板上进行骨生物矿化²。牙本质是一种骨状基质，即嵌入牙本质小管的矿化胶原硬组织。矿化胶原蛋白是由胶原蛋白分子和纳米磷酸钙矿物质形成的有机-无机复合材料。

本文主要介绍透射/扫描电镜（TEM/SEM）技术在牙本质胶原蛋白矿化表征中的应用。

案例一

图2 PA修饰胶原纤维示意图³

牙本质组织主要由两部分组成：无机矿物（主要为羟基磷灰石，简称HAP）和有机基质（主要为胶原蛋白纤维和非胶原蛋白，简称NCPs）。非胶原蛋白，如牙本质唾液蛋白、磷蛋白和蛋白聚糖，其作用是调节胶原支架的矿化以形成牙本质组织。蛋白聚糖由与糖胺聚糖（GAGs）侧链共价连接的小蛋白核心组成。GAGs被认为是相邻胶原纤维之间的桥梁，通过形成桥接交叉带，维持牙本质有机基质中胶原纤维的结构完整性。

原花色素（PA）是广泛存在于可可豆、葡萄籽、植物根状茎等中的黄酮类化合物。

本研究构建了PA修饰的胶原纤维，验证PA是否可以作为GAGs的类似物，促进牙本质胶原纤维矿化。

图3 不同治疗后I型胶原蛋白的TEM图³

研究人员首先将I型胶原纤维置于羧甲基壳聚糖/无定型磷酸钙（CMC/ACP）矿化溶液中进行矿化，通过TEM观察不同浓度的PA修饰胶原纤维的矿化。胶原矿化的第1天，可观察到胶原纤维具有特征性明暗间隔周期性条纹结构，即D-Band结构。并且液体状的ACP纳米颗粒表现出聚集在胶原周围的趋势，随着PA含量的增加，ACP前体的数量和胶原纤维的直径随之增加（图3a-d）；矿化第3天，针状ACP纳米粒子沉积在间隙区，并平行于胶原原纤维的长轴排列（图3e-h）；矿化的第5天，胶原纤维的D-Band结构消失，大量矿物质嵌入胶原纤维纵向生长，特别是在6%PA修饰组矿化尤为明显（图3l）。此外，能谱检测元素分析(TEM-EDX)证实了Ca元素和P元素在6% PA修饰的胶原纤维内部分布良好（图3m-p）。以上实验结果表明，PA的存在增强了ACP纳米颗粒的聚集并实现了更有效的胶原矿化。

图4 牙本质SEM图（a-b：对照组；c-d：PA处理组）³

通过SEM观察PA对牙本质胶原纤维超微结构的影响，可以发现对照组胶原纤维表现出明显的结构改变，例如塌陷、断裂和分支（图4a-b）；PA处理组中可以观察到完整且致密的胶原蛋白纤维（图4c-d ）。

图5 不同处理组的酸蚀脱矿牙本质SEM图³

采用磷酸酸蚀法建立人工牙本质龋模型。将牙本质样品经磷酸酸蚀脱矿后分为三组：A组为阴性对照组，将样品浸入去离子水中制备；B 组将新鲜制备的 6%PA溶液涂到牙本质表面，然后再将1% CMC/ACP矿化液涂到样品表面3min进行再矿化处理；C组仅用CMC/ACP矿化液进行再矿化处理。SEM观察到：对照组中牙本质小管完全暴露，孔口塌陷（图5a和d）；1% CMC/ACP矿化液处理组，部分牙本质小管被形成的新矿物质遮盖（图5b和e）；对于PA+CMC/ACP组，牙本质小管完全被覆盖，牙本质表面有明显的矿物质沉积（图5c和f）。

图6 牙本质SEM图及能谱元素分析图³

在大鼠口腔环境模型中评估PA + CMC/ACP 纳米颗粒的潜在临床应用。分别将对照组、PA + CMC/ACP 处理的牙本质在大鼠腭中放置14天，收集并固定牙本质标本进行SEM观察：对照组牙本质小管暴露，几乎没有矿物质沉积，并有大量细菌附着在牙本质表面（图6a-c）；PA + CMC/ACP 处理组牙本质表面有明显且致密的矿化层出现，很少有细菌附着（图6d-f）。能谱元素分析（EDX）结果表明Ca/P与HAP接近（图6g-h ）。

综上，本研究通过SEM观察到PA作为糖胺聚糖的类似物可以保存胶原纤维支架的孔隙度，并可与CMC/ACP矿化液协同提高牙本质的仿生再矿化，并对致龋菌表现出良好的抑制作用，为牙本质龋的药物治疗提供了新的思路。

案例二

图7 HA修饰的矿化胶原支架（HA-MCS）示意图⁴

牙本质再生结构复杂，与体外磷酸钙过饱和再矿化不同，矿化胶原支架材料可以招募人牙髓干细胞（hDPSCs），诱导其在体内分化，实现牙本质修复。

透明质酸（HA）是细胞外基质（ECM）的主要成分之一，可用于交联胶原纤维，参与矿化。

受牙本质生物矿化的启发，本研究制备了一种生物分子透明质酸（HA）修饰的仿生矿化胶原支架（HA-MCS），并证实HA-MCS可通过调节机械微环境增强hDPSCs的增殖和分化，促进牙本质再生。

图8 自组装胶原纤维TEM图⁴

将酸解提取的鼠尾I型胶原重构成I型胶原纤维HA-MC后通过TEM进行表征，观察到I型胶原蛋白分子重构成的胶原纤维具有特征性明暗间隔D-Band结构，结构周期为67 nm（图8）。

图9 矿化胶原纤维TEM图⁴

实验证实1.2 mg/mL浓度的HA预处理组中矿化胶原的模量和硬度接近天然牙本质。将两组胶原纤维置于矿化液中矿化4h后，TEM 观察到：对照组中胶原纤维仅有部分矿化；1.2 mg/mL HA 处理组中的胶原纤维几乎完全矿化（图9）。

图10 矿化胶原纤维SEM图⁴

本研究制备了3种胶原蛋白支架（图10a），脱水后发现，由于磷酸钙矿物质的沉淀，矿化的胶原蛋白支架，尤其是HA修饰的胶原蛋白支架比未矿化的胶原蛋白支架更白（图10b-d）。SEM观察到：对照组纯胶原纤维具有典型的D-Band结构（图10e和h）；矿化组中纤维状轮廓仍然清晰存在，但明暗相隔D-Band结构逐渐模糊，表明发生了矿化（图10f、g、i和j）。后续实验也表明HA修饰的胶原蛋白支架矿化效果更好。

综上，本研究通过SEM观察得出，生物分子HA通过氢键与胶原纤维结合，促进胶原纤维矿化，调节其力学性能。

参考文献

Jiayi Zhu, Zhulian Li, Yaping Zou, et al. Advanced application of collagen-based biomaterials in tissue repair and restoration [J]. Journal of Leather Science and Engineering, (2022) 4:30.
张展,张春,郭崎峰. 鼠尾I型胶原的酸解、纤维重构和仿骨生物矿化研究[J]. 浙江大学学报（医学版）, 2016,45（6）:592-597.
Ye Zhang, Ying Huang, Yanyun Pang, et al. Modification of collagen with proanthocyanidins by mimicking the bridging role of glycosaminoglycans for dentine remineralization [J]. Materials & Design, 210 (2021) 110067.
Wenjing Jin, Haiyan Wu, Jue Shi, et al. Biomimetic mineralized collagen scaffolds enhancing odontogenic differentiation of hDPSCs and dentin regeneration through modulating mechanical microenvironment [J]. Chemical Engineering Journal, 460 (2023) 141800.

内容来源：科享家

责任编辑：展源

审　　核：何发

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