重现性不好，原因出在哪？

张明 0 2024-03-08

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作为色谱工作者，开发方法是不可避免的。即使有国标或行标，也需要在实验室里从头到尾演练一遍，不可能原封不动地套用原有的公式。随着仪器的高、精、尖趋势发展，国标或行标会正逐渐显得太过于繁琐和落后。但你也可以抛开国标，针对自己实验室的现有仪器装备，开发出一套别出心裁、简便快捷的方法。

Part 1

开发方法，不可避免地要对方法进行评价。如何评价呢？

主要有两方面：

一是实用性，看看你这方法是否实用，是否能够推广，如果你只想在自己的实验室用一用，也可不必考虑这一方面；

二是可靠性，评价可靠性的主要指标有检测限、线性范围、回收率、重复性与重现性等等。可靠性是必须评价的。

Part 2

重复性与重现性的区别与联系？

重复性（repeatability）与重现性（再现性，reproducibility），二者都是用来评价分析结果的精密度。大多数人都不作严格区分，有的文献中还常常混用。但是二者的实际意义是不一样的。

重复性： 是指同一分析人员在同一条件下所得分析结果的精密度，

重现性： 是指不同分析人员或不同实验室在各自的条件下所得分析结果的精密度。也就是说，重现性比重复性提出了更高的要求。重复性好，重现性未必好。而重现性好，重复性肯定好。二者都是用多次分析结果的RSD来表示。

对现代仪器分析而言，重复性是容易实现的，而重现性是更重要的，也是方法验证必须考察的。

方法的重现性包括连续多次进样分析的重复性、不同天数间的重复性、不同型号仪器间的重现性和不同实验室间的重现性。

Part 3

何时必须进行重现性实验？

当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性试验。例如，建立兽药典分析方法时应通过不同实验室的复核检验得出重现性结果，复核检验的目的、过程、重现性结果均应记载在起草说明中。应注意重现性试验用的样品本身的质量均匀性和贮存运输中的环境影响因素，以免影响重现性结果。

重复性实验和重现性实验的先后顺序？

方法开发人员，首先应测定重复性。即在相同条件下连续进样5－10次，一般要求保留时间的RSD不大于1%，峰面积的RSD不大于5%。

如果样品要经过预处理，还应测同一样品多次处理的重复性。即同一样品取3－5份作平行处理，测定结果的RSD不应大于5%。某些工业分析要求不大于10%。至于天与天之间的重复性也不应大于10%。

当上述重复性满足要求后，说明该方法在你的实验室是可靠的。

要将此方法推广使用，还必须测定不同仪器、不同分析人员、不同实验室之间的重现性。

当这些重现性都能满足要求时，这一方法的的可靠性就得到较为满意的验证。

Part 4

重现性不好，怎么找原因？

HPLC分析时保留时间重现性不稳定可能的原因？

HPLC分析时，保留时间重现性不稳定会影响峰面积的重现性，从而造成实验数据不精确，色谱分析无法进行，造成这方面的原因有很多，常见的解决方案与排查方法如下：

确认色谱柱是好的；

确认流动相是新鲜配置的，比例没有错误；

检查一下溶剂瓶里的溶剂过滤器没有长菌，没有被堵塞；

如果使用梯度洗脱方法，请确认平衡时间足够长；

如果是压力不稳定，一定会影响保留时间；

仔细观察柱前压的变化，如果压力稳定，就可以判断泵的系统没有问题，请更换新的色谱柱试试。

GC重现性不好，可能原因是？

定量不重复的原因有很多，一般是两大类：

一类是单纯性的灵敏度变化型，即除了定量重复性不合格外，其它指标未发现异常；

另一类为伴随性灵敏度变化型，即除灵敏度变化之外还伴随着其它异常现象出现，包括基线不稳定性、峰保留时间变化及产生峰形畸变等异常现象。

属于第一类型故障的原因主要是：进样技术不佳、注射器有堵漏，样品制备不均匀、进样口污染物堆积以及气路存在漏气现象等；

属于第二类型故障的原因主要是：载气流量变化，检测器玷污、过载，柱温变化以及检测器操作条件（如氢气、极化电压、脉冲电压等）发生变化。

检测方案如下：

(1)进样技术检查，进样技术不佳是造成色谱峰不重复的最可能原因。它通常表现为峰高、峰面积忽大忽小，峰高、峰面积大小变化无规则。提高进样重复性的关键，在于始终保持进样操作个大步骤的重复性，这包括取样操作，取样到进样期间的空闲时间，进针快慢及拔出注射器的早晚，通常操作人员在经过较多地进样重复性训练之后，可以达到所需的要求。

(2)注射器的检查，操作人员进样技术提高后，色谱峰灵敏度仍然无显著改观，需认真检查注射器本身是否有堵塞或泄露现象，必要时更换一个好的注射器重新进样实验。