色谱基础：前处理对色谱图的影响

张明 0 2024-03-26

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色谱前处理

前处理对色谱图的影响

样品制备错误对色谱图的影响

样品制备步骤错误可能会导致许多问题。此处显示的问题只是一个例子，说明色谱图如何会因偏离推荐操作步骤而受到严重影响。

为了分离三环类抗抑郁药，必须进行固相萃取 (SPE)。操作步骤如下：

先用 1 mL甲醇，再用 1 mL 水润湿 SPE 柱。
加入 1 mL 样品溶液，
再用 1 mL 5%甲醇水溶液淋洗，
最后用 1 mL 甲醇洗脱目标物。
蒸发溶剂，并用200 μL 磷酸盐缓冲液/甲醇（80:20）复溶。

然而，如果使用 2% 的磷酸甲醇溶液从 SPE 柱中洗脱分析物，则在蒸发过程中酸会浓缩，并导致药物发生质子化，最终样品溶液中的磷酸含量约为 10%。因此，三环类抗抑郁药的保留时间变短，色谱峰变形，如图 1 所示。

样本：20 μL 含三环类抗抑郁药的溶液（诺多西平、去甲替林、多虑平、阿米替林）

色谱柱：3.9 mm × 15 cm

固定相：Symmetry C18，5 μm（反相 C18）

流动相：20 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7）/ 甲醇 = 32 : 68，1 mL/min

柱温：35℃

检测器：UV 254 nm

萃取溶剂的稳定性不足

尽管氯仿是一种有毒溶剂，但仍被用于从生物样本中萃取蒽环类化合物。在有氧气存在的情况下，氯仿会反应生成光气 CO(Cl)₂，添加稳定剂可以防止这种反应。除了非稳定级氯仿，市场上还有乙醇或戊烯稳定的氯仿。乙醇比戊烯更有效，因为乙醇会与光气反应生成氯甲酸乙酯 (Cl-CO-O-C₂H₅)。

另一方面，光气会攻击胺并将其转化为氨基甲酰氯 (R-NH-CO-Cl 或 (R₁,R₂)-N-CO-Cl)。如果在萃取蒽环类样品时使用未稳定或不稳定的氯仿，光气会与分析物发生反应，因为它们含有氨基。在本示例中，蒽环类化合物用乙醇（图 2 上）或二甲苯（图 2 下）稳定的氯仿萃取。由于戊烯的稳定性较差，后一种溶剂中含有微量光气，从而降低了蒽环类化合物的浓度，并产生了一些额外的色谱峰。

样品：蒽环类化合物和代谢物，pH 值为 9.0，用乙醇或戊烯稳定的氯仿萃取

色谱柱：4.6 mm × 15 cm，保护柱 4 mm × 4 毫米 4.6 mm × 15 cm，保护柱 4 mm × 4 mm

固定相： Merck Purospher Star RP-18，5 μm（反相 C18）

流动相：水/乙腈加 0.1%甲酸，1.0 mL/min，梯度洗脱

柱温：30℃

荧光检测器：480/555 nm