最全调整流动相的条件以适应LCMS分析策略

赵桂芝 0 2024-10-17

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流动相是影响液相色谱的关键因素。一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。高效液相色谱法中的流动相主要用水性溶剂、有机溶剂或它们的混合液，但是如何配制。选择配制的方法不同，分析结果特别是保留时间，是会有显著差别的。

调整流动相的条件以适应LCMS分析主要涉及以下几个方面：

选择合适的流动相组成

常用的流动相包括乙腈、甲醇、水以及它们不同比例的混合物，还可以加入易挥发的酸碱如甲酸、乙酸和氨水等调节pH值。应避免使用非挥发性缓冲盐，如磷酸盐，因为它们可能导致LCMS接口堵塞。

（1）流动相应不改变填料的任何性质。低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有时遇到某些有机相会溶胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质。碱性流动相不能用于硅胶柱系统。酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。

（2）纯度。色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。

（3）必须与检测器匹配。使用UV检测器时，所用流动相在检测波长下应没有吸收，或吸收很小。当使用示差折光检测器时，应选择折光系数与样品差别较大的溶剂作流动相，以提高灵敏度。

（4）粘度要低（应<2cp）。高粘度溶剂会影响溶质的扩散、传质，降低柱效，还会使柱压降增加，使分离时间延长。最好选择沸点在100℃以下的流动相。

（5）对样品的溶解度要适宜。如果溶解度欠佳，样品会在柱头沉淀，不但影响了纯化分离，且会使柱子恶化。

（6）样品易于回收。应选用挥发性溶剂。

优化流动相的pH值

留意色谱柱说明书中的pH适用范围，目前市面上大部分键合硅胶色谱柱表示的pH适用范围是2-10，但在实际使用时应避免极端的pH条件。pH值的调整要考虑到待测化合物的pKa值。一般来说，pH值应至少高于pK值两个单位，以便于化合物的离子化。对于酸性样品，如含有谷氨酸和天冬氨酸的肽类，可以用氨水或三乙胺进行碱化。

对于可电离的化合物，要获得最强的反相保留，分析物应尽可能的不带电或电离，此时分析物极性相对较小，在反相色谱柱上的保留就更强，中性化合物无任何可电离基团，不受pH影响。

酸性和碱性化合物在其未电离状态下时反向保留最大，中性化合物的保留不受pH影响。

选择适当的流动相添加剂

为了提高离子化效率，可以在流动相中加入一些添加剂，如甲酸铵、乙酸铵等。这些添加剂可以帮助调节pH值，并促进化合物的离子化。

酸类

（1）甲酸：通常使用的浓度在1%以下，能够让水的pH达到二点几的级别。

（2）乙酸：酸性比甲酸略弱，通常使用浓度不超过5%，能够使水的pH到达到二点几的级别。

（3）三氟乙酸：比较强的酸，使用浓度通常不超过0.5%，能使水的pH达到2以下，具有很大的离子强度及一定的离子对作用，是分析蛋白/多肽时常用的添加剂。

以上三种酸最致命的问题在于低波长下的紫外吸收，通常不建议在小于215nm波长的情况下使用，另外就是甲酸/乙酸还有比较大的挥发性，时间久了浓度会发生变化。

（4）磷酸：这是一种不挥发性的酸，离子强度也不错，最重要的是，它在低波长紫外区无本底吸收，但是它也存在不少缺点，比如不能兼容质谱方法，对色谱柱寿命影响大等。

除此之外，还有一些其他的酸，比如硫酸，盐酸或者柠檬酸，但是都是非常少的使用了。

碱类

碱类添加剂常见的是氨水和三乙胺，两者都能让水的pH到达非常高的水平，高到能把硅胶颗粒溶解掉，要慎用，另外就是这两种溶剂通常不太容易很干净，尤其是三乙胺，即使是色谱纯，放的久了也可能会由于变质导致污染。

盐类

比起单纯的酸碱，盐类，特别是具有缓冲能力的盐类可以很好的控制流动相的pH值，根据不同缓冲盐中两种盐的配比，可以很容易的配置出一定pH的缓冲溶液。

（1）甲酸盐

通常在液相色谱中常用的甲酸盐都是甲酸铵，这类盐的溶解度好，完全兼容液质联用的方法，对色谱柱的伤害也比较小，但是缺点是离子强度比较低，另外就是甲酸盐比较容易吸潮，称量的时候比较困难，在流动相里还可能挥发。

与甲酸配合，可以得到甲酸-甲酸铵缓冲体系，大概缓冲能力在pH3～4.5的范围之内，只要调节两者浓度的比例即可。

（2）乙酸盐

常见为乙酸铵，在使用上，和甲酸盐十分类似，离子强度也不高，与乙酸配合的乙酸-乙酸铵缓冲体系pH的控制能力在pH4～5.5左右。

（3）磷酸盐

常用的是磷酸的钠盐和钾盐，二者对pH的控制能力十分接近，只是离子强度稍有差异，绝大多数情况下是可以互换使用的，磷酸由于是多元酸，能够形成一氢盐和二氢盐，所以使用磷酸缓冲体系调节pH也是组合比较多，跨度比较大的，并且可以提供较高的离子强度，可惜，磷酸盐流动相体系无法兼容质谱，并且对色谱柱损伤较大。

以磷酸钠盐为例，可以有以下两种组合的缓冲体系：

磷酸-磷酸二氢钠：pH可以达到1.2～3.1左右的范围；

磷酸二氢钠-磷酸氢二钠：pH可以达到6.5～8左右的范围。

上述的缓冲对能调节的pH范围指的都是在保持缓冲能力的范围之内，如果仅仅是调节pH的话，范围还可以再扩展一些。

确定合适的流速

流速的选择需要结合所用色谱柱的内径、柱分离效果以及流动相的组成进行考虑。较小的流速可以获得较高的离子化效率，因此在条件允许的情况下，最好采用内径较小的色谱柱。

1）柱压过高时，尽可能采用较小的流速，以不超过柱最大允许压力的一半为宜。

2）当流速较大时，应采取流速梯度的办法使流速分步到位。

3）使用手动进样阀时，进样阀的切换要尽可能的快。否则超过20%的压力冲击会很快使柱报废。当使用多柱联用时，柱切换要避免在高压下进行。

考虑色谱柱的温度

色谱柱的温度会影响分离效果和离子化效率。通常，色谱柱的温度可以设置在30℃至50℃之间，以获得较好的分离效果。

一般以硅胶为基质的色谱柱最高使用温度不超过60℃，以低于40℃为宜，特别是在流动相pH接近使用限度时，更应降低使用温度。

温度过高会加快键合相的水解和硅胶的溶解，从而使填料性质改变，柱床塌陷，降低柱效，改变峰形。

流动相优化策略

（1）由强到弱

一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)进行试验，这样可以很快地得到分离结果，然后根据出峰情况调整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例。

（2）三倍规则

每减少10%的有机溶剂(甲醇或乙腈)的量，保留因子约增加3倍，此为三倍规则。这是一个聪明而又省力的办法。调整的过程中，注意观察各个峰的分离情况。

（3）粗调转微调

当分离达到一定程度，应将有机溶剂10%的改变量调整为5%，并据此规则逐渐降低调整率，直至各组分的分离情况不再改变。

溶剂强度顺序：水＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜四氢呋喃＜丙酮＜二氯甲烷其中二氯甲烷和水不互溶，其余和水互溶。TIPS:根据实际情况，有时使用混合流动相会有很好的效果。

注意事项

流动相通常由水或缓冲溶液与有机溶剂混合而成。原则上，所有经过色谱柱的流动相均应过滤，但在实际操作上应视具体情况而有所区别：当有机溶剂用色谱纯级，水用石英亚沸水或其它超纯水时，在能确保水和有机溶剂的质量且没有受到污染时，过滤并无更多实际意义。

当流动相中含有缓冲盐时，则过滤是必要的，如前所述，当缓冲溶液放置一段时间，在使用前还应重新过滤（含有缓冲盐的流动相，长菌较快，建议现用现配）。

所配制的样品试液在注入流路系统前均要经0.45μm(0.22μm则更好)孔径滤膜过滤。要注意区分水系和油系，二者不可混用，以防止滤膜溶解而造成污染。

装流动相的容器和色谱系统中的在线滤器要定期清洗和更换，以避免滤器因过载而起不到过滤作用。

通过以上步骤，可以有效地调整流动相的条件，使其适应LCMS分析的需求。

内容来源：质谱学堂

责任编辑：展源

审　　核：何发

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