三组分酶催化交叉偶联反应在理论上具有显著的优势，但其发展面临以下三个挑战：

1.酶的活性位点通常是为特定功能演化而来，在其有限的构象和化学环境中容纳多种底物或自由基中间体本质上非常困难；

2.要在三种不同自由基的反应中实现高度的选择性（包括化学选择性和立体选择性），需要克服诸多障碍，例如避免此前已被报道的双自由基偶联副反应；

3.需突破酶的天然反应倾向，如其对苯甲酸衍生物的偏好，从而扩展其催化范围。

成果简介

基于此，南京大学黄小强研究员和厦门大学王斌举教授（共同通讯作者）等人通过重新设计焦磷酸硫胺素依赖酶，并结合可见光催化，构建了一种三组分光生物催化体系。在该体系中，广泛存在的硫胺素依赖酶促进了碳-碳键的形成，突破了自然界中双电子机制的限制。

作者开发了一种双光催化/生物催化体系，用于实现具有化学选择性和对映选择性的三组分自由基交叉偶联反应。以三类易得的起始材料为底物——醛类作为酰基自由基前体，α-溴羰基化合物作为亲电自由基前体，烯烃作为自由基受体——通过重新设计的三组分自由基酶（3CRE），成功合成了多种富对映体的酮类化合物。该方法在立体选择性上表现出卓越的性能，在33个测试实例中，有25个实例的对映选择性达到≥97% ee。

相关工作以《Synergistic photobiocatalysis for enantioselective triple radical sorting》为题在发表在最新一期《Nature》上。

本文的第一作者分别是南京大学邢仲秋博士和刘福露特任副研究员、厦门大学冯键强博士。

图文解读

作者选用4-苯基基苯甲醛（1a）作为酰基供体、苯乙烯（2a）作为烯烃组分以及溴丙酮（3a）作为亲电性自由基前体，将这三种底物作为模板底物，系统研究了[Ru(bpy)3]Cl2•6H2O与硫胺素二磷酸（ThDP）依赖酶组成的催化体系。在蓝光发光二极管（450–460 nm LEDs）照射下，作者筛选了多种ThDP依赖酶。值得注意的是，仅荧光假单胞菌（PfBAL）来源的苯甲醛裂解酶的无细胞提取物能够催化目标三组分反应，尽管产物 (S)-4a 的产率仅为3%，但其对映体过量（ee）已达到90%。

图1.光生物催化向三组分自由基的演变

通过广泛的工程设计，作者筛选并确定了具有5个突变的最优酶变体3CRE-1。在直接使用无细胞裂解物的情况下，3CRE-1催化生成目标产物4a的产率达到70%，对映体过量（ee）高达99.5%，同时有效避免了天然安息香凝聚副产物5a的生成（产率仅为5%）。

在分子动力学模拟和半理性迭代位点特异性突变策略的指导下，作者对酶进行了优化改造。研究发现，T481L和A480G位点的突变对提升反应的对映选择性起到了促进作用，而Q113H和N283F位点的突变则显著提高了反应的收率。经过五轮突变，最终获得了最优变体3CRE-1。

进一步的条件优化证实，3CRE-1是模型反应的最佳催化剂。同时，对照实验明确表明，蛋白质、ThDP辅助因子、光氧化还原催化剂以及可见光均是实现该新型反应不可或缺的关键因素。

图2.酶促反应和定向进化

一系列含芳基或杂芳基取代基的醛类底物表现出良好的反应性能，均实现了优异的对映体选择性（对映体过量均≥99%，4a-f）。值得注意的是，杂芳基酮（4c-f）作为过渡金属催化C-H功能化的潜在底物，兼具弱配位和强配位位点，展现了独特的应用潜力。此外，芳香醛底物无论携带给电子基团还是吸电子基团，均能够良好适应催化体系（4g-k）。甚至对于较具挑战性的邻氟苯甲醛（4l）和苯并噻吩醛（4m），反应也能顺利进行，进一步验证了该体系的广泛适用性。

无论取代基的电子性质（4n-q）或取代位置（4q-s）如何，大量现成的烯烃均能被成功转化为富含对映体的1,5-二酮类化合物。杂环烯烃如噻吩基（4t）、呋喃基（4u）和吡啶基（4v）也能很好地适应光生物催化体系，而偶联二烯的主要反应产物为1,7-二酮（4w）。

此外，通过使用不同的自由基前体，可以引入多种功能基团，如酮（4y-aa）、酯（4ab, 4ae）和腈（4ac），显著拓展了目标产物的结构多样性。特别是使用市售二氟甲基化试剂3g，成功合成了对映选择性优异的二氟酮（4ad）。

综上，该催化体系在立体化学控制方面表现出卓越的性能，同时具备温和的反应条件和对多种官能团的广泛耐受性，为实现分子复杂性提供了一种极具吸引力的生物催化新方案。

图3.底物拓展

图4.机理研究

文献信息

Synergistic photobiocatalysis for enantioselective triple radical sorting. Nature, 2024, https://doi.org/10.1038/s41586-024-08399-5.