捷伦高分离度快速液相色谱/质谱仪（RRLC/MS）

本文建立了高分离度快速液相色谱(RRLC)分离7种常见降糖中药中化学药品的分离方法与单四极质谱（MSD）的检测方法。对中成药中添加的降糖西药用RRLC快速分离，用DAD检测器得到的色谱图和光谱图进行定性，并使用单四极质谱检测器进行定量与定性鉴别；同时采用液质联用方法测定中成药中添加这些化学药品的加样回收率。结果七个对照品均产生[M+H]+分子离子峰，对于两种不同样品基质的加标回收率在64.4%~100.7%之间。因此，该方法可作为检测降糖中成药中非法添加化学药品的通用方法。

实验条件

液相色谱条件

■Agilent 1200 SL系列液相色谱仪，配置有G1312B二元泵（低延迟体积配置），G1379B脱气机，G1367C自动进样器，G1316B柱温箱，1315C二极管阵列检测器。

■色谱柱：ZORBAX SB C18 （2.1×50 mm，1.8μm）。

■流动相为乙腈：0.2%甲酸水溶液；梯度：0~4min，乙腈：10%~90%；Stop time：6min；Postrun：3min。

■流速：0.4ml/min。

■柱温：40℃。

■进样量：2μl。

■检测波长：235nm。

■质谱分析条件

■Agilent 6130单四极杆质谱仪，配置了ESI离子源。

■在（+）ESI模式下，采集数据。

■经实验优化设定质谱参数如下：Capillary3000 V，Drying Gas 8 L/min，Neb Press 35 psi，Gas Temp 350℃，Fragmentor 70。

试剂与试药

甲醇、乙腈（HPLC级，Merck，Darmstadt Germany），甲酸（HPLC，Merck，Darmstadt Germany），纯净水（乐百氏食品饮料有限公司）。

图1. 七种对照品的质谱分析结果-SIM。

对照品包括双胍类：盐酸二甲双胍；磺酰脲类：格列美脲、格列吡嗪、格列齐特、格列本脲；其他：盐酸吡格列酮、瑞格列奈。上述皆购自中国药品生物制品鉴定所。

供试药品共12种，包括：消渴丸、降糖甲片、消渴灵片、金芪降糖片、浓缩苦瓜粉胶囊、降糖胶囊、糖尿乐胶囊、止渴降糖胶囊、地骨降糖胶囊、十八味诃子利尿胶囊、降糖宁胶囊、珍芪降糖胶囊。上述皆为市售药品。

实验方法

对照品配制

分别精密称取盐酸二甲双胍、格列美脲、格列吡嗪、格列齐特、格列本脲、盐酸吡格列酮、瑞格列奈10mg，加入50ml容量瓶中，加入适量甲醇超声溶解，甲醇定容得到储备液，取储备液用甲醇稀释10倍得到DAD检测时的工作溶液（~20μg/ml），将上述工作溶液稀释20倍得到MS检测时的工作溶液（约为~1.0μg/ml）。

供试品提取方法

片（丸）剂：取片（丸）剂10片（粒），称重，研磨粉碎成细粉，置50ml容量瓶中，甲醇定容，超声提取15min，放至室温后，补足损失体积，提取液过0.45μm滤膜，液相分析，UV检测器，使用质谱检测器时，需稀释20倍进样。

图2. 消渴丸RRLC-UV色谱图（下）以及与混合标准样品色谱图比较（右上）。

胶囊内容物：取胶囊10粒，完全取出内容物，称重，后面操作同片剂。

胶囊外壳：胶囊壳10粒，称重，用粉碎机粉碎成细粉，称相当于2个胶囊壳的重量，至10ml容量瓶中，后操作同片剂。

回收率实验

取两种不同的阴性检出样品基质（片剂和胶囊内容物），分别加入对照品，按照样品前处理方法处理，测定，用SIM谱图计算加样回收率，同时做空白加入的平行实验（每种基质加标和空白各两份）。

结果和讨论

波长选择

由光谱图可以看出，被检测物质由于结构中不含有强的共轭结构，所以紫外最大吸收都处于较低波长，即在220~240nm之间，故紫外检测波长选定为235nm。

流动相的选择

目标组分均含氮原子，故采用用甲酸体系进行分离时，可产生较好的正离子信号。因七种物质结构不同，疏水性差异大，故采用梯度色谱进行分离。分离结果表明，除了在流动相条件下不保留的盐酸二甲双胍，其他几种被检测物质均有良好的保留与分离，并且整个分离在6分钟之内完成。因采用甲酸为流动相组分，且分离采用梯度方法，故在低波长下（235nm）紫外检测的基线有明显的变化。但对待测物质的质谱检测和分离没有影响（见图1）。其中瑞格列奈因其两性官能团结构，在该流动相条件下色谱峰较其他组分相比有一定程度的展宽。

本工作使用2.1mm内径的色谱柱，流速0.4ml/min，可以不分流直接进入质谱分析，有助于获得良好的质谱信号。由于不使用高浓度缓冲盐等极端条件，此方法对色谱柱损害很小，进样135针，柱效无明显降低。

供试样品分析结果

虽然只有七种对照品，但是质谱检测时，同时对十二种违禁添加成分的分子离子进行了扫描，供试样品中未发现七种对照品之外的目标组分。未检出上述12种违禁添加成分的供试品有10种：降糖甲片、消渴灵片、金芪降糖片、浓缩苦瓜粉胶囊、降糖胶囊、糖尿乐胶囊、止渴降糖胶囊、地骨降糖胶囊、十八味诃子利尿胶囊、降糖宁胶囊。

图3. 消渴丸RRLC-SIM色谱图（下）以及与混合标准样品色谱图比较（左上）。

阳性检出样品

在消渴丸中检测出格列本脲。外标法计算含量约为2.8mg/片（本药品说明书中明确标明有阳性添加格列本脲，2.5mg/片），与药品说明书中的含量相符。珍芪胶囊中检测出标签中未标注的违禁化学药物瑞格列奈。

由色谱图可见：阳性样品不仅在质谱分析中可以观察到相应的色谱峰，在DAD采集的紫外色谱图上亦可发现较强的色谱信号（图2和图3），且DAD采集的相应的色谱峰的紫外光谱亦可对色谱峰提供有价值的确认信息。因此，RRLC-DAD可以作为目标组分阳性的快速筛查手段。但因中药成分复杂多变，简单方法很难实现不同基质中所有成分在色谱上的完全分离，故DAD常常可能得到的是混合的色谱和光谱信息。在进行阳性确认时，需要质谱等手段进行进一步鉴定。

单四极质谱检测器作为阳性筛查与鉴定之简单、易用的方便手段，可以对大多数样品进行分析鉴定。

盐酸二甲双胍的确认

盐酸二甲双胍极性很强，在色谱柱上不保留，在分离检测过程中，会受到基质中强极性物质（如糖类物质等）的干扰，造成较低的回收率和结果的不确定性。但因其需要加入的剂量较大，故即便有离子抑制现象发生，亦可检出。鉴于实际供试样品的UV和SIM分析结果中往往在二甲双胍的保留时间处可以看到色谱峰，故在对所检测药品进行阳性确证时，需要质谱进行进一步确证。