摘　要:采用荧光光谱、紫外吸收光谱和圆二色谱(CD) 研究了聚乙二醇200 基硝苯柳胺与钥孔戚血蓝蛋白( KL H) 的相互作用。结果表明,聚乙二醇200 基硝苯柳胺对KL H 的荧光猝灭机制属于静态猝灭;由Lineweaver2Burk 方程计算出不同温度下结合常数K ,由Van’t Hoff 方程计算出△H 和△S 平均值,结合力主要为静电作用力;根据FÊrster非辐射能量转移机制求得给体与受体间的结合距离r = 5. 76 nm ;同步荧光光谱表明,聚乙二醇200 基硝苯柳胺能够被KL H 存储和转运,但结合时对蛋白的构象有一定的影响;圆二色光谱的数据表明相互作用后KL H 的二级结构发生了改变: KL H的α2螺旋的含量从43. 1 %下降到37. 8 %。

关键词:硝苯柳胺;钥孔戚血蓝蛋白;荧光光谱;紫外吸收光谱;圆二色谱

中图分类号:O657. 3 　　文献标识码:A 　　　文章编号:100626144 (2010) 0120011204

硝苯柳胺是一种重要的杀蚴剂,对尾蚴也有一定的杀灭作用,在预防日本血吸虫病中有重要作用[122 ] 。由于硝苯柳胺难溶于水,难以直接作为杀蚴剂使用。为增强其水溶性,在硝苯柳胺分子的羟基上连接聚乙二醇200 非离子型表面活性基团,发现改性后的聚乙二醇200 基硝苯柳胺具有良好的杀蚴作用。血蓝蛋白又称血清素,在生物体内的生理功能相当于血红蛋白,是一种重要的氧载体[3 ] 。钉螺是软体动物门腹足纲中重要的螺类动物,钉螺的血液中含有的呼吸色素主要是血蓝蛋白。采用荧光光谱法研究聚乙二醇200 基硝苯柳胺与钥孔戚血蓝蛋白( KL H) 的相互作用目前尚未见相关报道。

本文研究了聚乙二醇200 基硝苯柳胺与KL H 作用的荧光猝灭机理,通过热力学参数讨论了作用力类型,用同步荧光光谱考察了聚乙二醇200 基硝苯柳胺对KL H 构象的影响,采用圆二色谱(CD) 证实其构象发生变化。该研究为进一步了解聚乙二醇200 基硝苯柳胺灭钉螺机理提供一定帮助。

1 　实验部分

1. 1 　仪器和试剂

LS255 型荧光光谱仪(美国, Perkin2Elmer 公司) ;Cintra 10 型紫外可见分光光度计(澳大利亚, GBC公司) ;J2810 型圆二色分光光度计(日本,J asco公司) ;Millipore 超纯水系统。聚乙二醇200 基硝苯柳胺按照文献[ 4 ]方法合成,并配制成1. 0 ×10 - 3 mol/ L 的储备液备用; KL H(购于Sigma2Aldrich 公司) 配制成1. 0 ×10 - 6 mol/ L 储备溶液,并于冰箱中(温度于0～5 ℃) 保存,其余试剂均为分析纯。

1. 2 　实验方法

1. 2. 1 　荧光光谱与紫外吸收光谱的测定

准确移取2. 5 mL 1. 0 ×10 - 6 mol/ L 的KL H 溶液于1 cm 的石英比色皿中,置恒温水浴锅中,用微量进样器逐次加入浓度为1. 0 ×10 - 3 mol/ L 的聚乙二醇200 基硝苯柳胺甲醇溶液进行滴定,滴定时每次加入体积为5μL ,滴定剂累加体积小于90μL ,因此可忽略体积效应。每次滴定完搅拌均匀,恒温5 min (298 K,310 K,320 K) 后,以λex = 280 nm ,测定300～445 nm 的荧光发射光谱,记录KL H 的荧光光谱及药物对KL H 的荧光猝灭光谱。固定激发和发射波长间隔△λ分别为15nm 和60 nm ,记录同步荧光光谱。测定聚乙二醇200 基硝苯柳胺(1. 0 ×10 - 6 mol/ L) 的甲醇溶液在300～445 nm 处的紫外吸收光谱,以无水甲醇溶液作空白对照。

1. 2. 2 　圆二色谱的测定

实验时光源系统用氮气保护(流量为10 L/ min) ,样品池的光径为0. 2 cm。测量参数:扫描速率100 nm/ min 。分辨率0. 1 nm ,响应时间1 s ,累积次数3 次。扫描波段为200～240 nm。KL H 浓度为2. 00 ×10 - 7 mol/ L 。向上述指定浓度KL H 中加入药物,控制药物与KL H 物质的量之比,测其CD 谱,并用仪器附带的杨氏法计算出二级结构单元的相对含量。

2 　结果与讨论

2. 1 　荧光光谱

由图1 可知,聚乙二醇200 基硝苯柳胺使KHL 的荧光发生猝灭,且随药物浓度的增加KHL 荧光强度逐步降低。

这表明两者之间存在着相互作用,且随聚乙二醇200 基硝苯柳胺浓度的增加两者的结合趋向饱和。在激发波长为280nm 时,色氨酸最大荧光发射峰在340 nm 左右[526 ] ,复合体系在340 nm 处荧光强度显著降低,这表明药物与KL H 结合时位于或接近于色氨酸残基。

2. 2 　猝灭机理和猝灭速率常数

假设此荧光猝灭是动态猝灭,则荧光强度可用Stern2Volmer 方程F0 / F = 1 + Kq∈0 [Q ] = 1 + KSV [Q ] 处理[7 ] ,以F0 / F 对[ Q ] 作Stern2Volmer 图, 作Stern2Volmer 曲线拟合,得出298 K、310 K、320 K时双分子猝灭过程速率常数分别为3. 73 ×1012 、3. 12 ×1012 、2. 88 ×1012 L•mol- 1 •s - 1 ,均大于猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭常数(2. 0 ×1010L•mol- 1 •s - 1 ) ,由此说明荧光猝灭不是动态双分子猝灭过程,而是由于聚乙二醇200 基硝苯柳胺与KL H结合形成了复合物引起的静态猝灭。

2. 3 　结合常数K

在静态猝灭中,结合常数K 与荧光强度、猝灭剂浓度之间的关系可以用Lineweaver2Burk 双倒数函数表示[8 ] : ( F0 - F) - 1 = F - 10 + K- 1 F - 10 [Q ]- 1 ,以( F0 - F) - 1对[Q ] - 1作双倒数图,求得聚乙二醇200 基硝苯柳胺与KL H 在298 K、310 K、320 K的结合常数分别为3. 78 ×104 、3. 12 ×104 、2. 51 ×104 L•mol- 1 , K值均为104 数量级,表明它们之间的结合力较强。此外,结合常数随温度升高而减小,进一步说明药物对KL H 的内源荧光猝灭过程主要为静态猝灭。

2. 4 　热力学参数和作用力类型

根据反应前后的焓变△H 和熵变△S 的相对大小,可以判断药物与蛋白质之间的主要作用力类型。

根据聚乙二醇200 基硝苯柳胺与KL H 的结合常数K ,并结合热力学方程求出不同温度下反应的△G、△H 和△S ,把得到的数据列于表1 中。从表1 中的数据可以看出: △H < 0 , △S > 0 ,所以聚乙二醇200基硝苯柳胺与KL H 之间的作用力主要为静电引力[9 ] 。但在许多情况下,有机小分子与蛋白的反应是多种力协同作用的结果,聚乙二醇200 基硝苯柳胺分子母核有较强的疏水作用,因此疏水作用力也可能参与了药物与KL H 间的作用过程。从热力学角度来看,在一定温度和压力下,药物与KL H 的结合反应能否自发进行取决于△G, △G< 0 时则有利于反应的自发进行。从表1 可以看出△G< 0 ,所以药物与KL H 之间的结合是自发进行的。

2. 5 　结合距离的计算

根据FÊrster的非辐射能量转移理论[10 ] ,在25 ℃时做出聚乙二醇200 基硝苯柳胺的紫外2可见吸收光谱和KL H 的荧光光谱,两光谱有一定程度的重叠(图2) 。求得光谱的重叠积分J = 1. 36 ×10 - 14 cm3 •L•mol- 1 ,转移效率为50 %时的临界距离R0 = 3. 80 nm 和转移效率E = 0. 076 ,进而求出给体2受体间距离r = 5. 76 nm , r < 7 nm ,从而说明聚乙二醇200 基硝苯柳胺与KL H 结合时是通过非辐射能量转移机制导致蛋白质的荧光发生猝灭的[11 ] 。

2. 6 　聚乙二醇200 基硝苯柳胺对KLH构象的影响

在△λ= 15 nm 和△λ= 60 nm 时,分别向KL H 溶液中逐渐增加聚乙二醇200 基硝苯柳胺的浓度(图3) 。随着药物的浓度逐渐增加,色氨酸残基的最大发射波长没有明显改变,而酪氨酸残基的最大发射波长缓慢地减小,说明聚乙二醇200基硝苯柳胺的加入对使酪氨酸残基周围的疏水性增加[12213 ] 。

这说明聚乙二醇200 基硝苯柳胺在钉螺体内能够被血蓝蛋白存储和转运时对蛋白构象有一定影响。

通过圆二色(CD) 谱可以灵敏地检测一些反应引起的蛋白分子的二级结构变化[14 ] 。如图4 所示, KL H 在209 nm 和221 nm 左右表现出两个负的吸收峰,主要为α2螺旋结构的蛋白质[15 ] 。随着聚乙二醇200 基硝苯柳胺浓度的增加,KL H 在209 nm 和221 nm 左右处两个负吸收峰的强度减小,但形状和肩峰的位置未发生明显改变,表明聚乙二醇200 基硝苯柳胺使KL H 中的α2螺旋的含量降低。通过CD 谱仪二级结构分析软件计算,α2螺旋的含量由42. 1 %下降到34.7 %,β2折叠含量由10. 2 %变为9. 1 %,而β2转角的含量由22. 8 %变为26. 9 %。以上结果表明,聚乙二醇200 基硝苯柳胺诱导KL H 发生了二级结构改变,这是导致KL H 内源性荧光猝灭的原因。