四种黄曲霉毒素的同时测定

肖尧，安蓉 0 2020-05-27

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本文主要研究食品基质中四种黄曲霉毒的测定方法.样品经过免疫亲和小柱净化,采用柱后光化学衍生方法和荧光检测进行测定,并对检出限,定量限,重现性,回收率等方面进行了方法学考察.

本文主要研究食品基质中四种黄曲霉毒的测定方法。样品经过免疫亲和小柱净化，采用柱后光化学衍生方法和荧光检测进行测定，并对检出限、定量限、重现性、回收率等方面进行了方法学考察。此法可以满足法规上关于定量限的要求，比起常用的柱后电化学衍生方法更加容易操作。

自然界中黄曲霉毒素有14 种之多，黄曲霉毒素B1 毒性最大。我国GBT 18979-2003 规定四种黄曲霉毒素总量检出限应为1 ppb。黄曲霉毒素测定通常使用HPLC- 荧光检测法，先将黄曲霉毒素衍生化，利用紫外光使其与水进行衍生反应，此法在灵敏度上与电化学衍生法也有可比性。

实验部分

仪器条件

安捷伦1260 Infinity 液相色谱系统；四元泵(G1311B) ；标准自动进样器(G1329B) ；荧光检测器(G1312B) ；标准检测池(8 μl) ；柱后光化学衍生装置；色谱柱:Agilent Poroshell 120ECC18,3.0×50mm,2.7 μm( p / n 699975-302) ；流动相: 水/ 甲醇（65:35，v:v）；柱温箱(G1316A) ；流速:0.4 ml/min ；进样量:10 μl ；柱温:30 ℃ ；检测器参数:Ex ：365 nm,Em ：440 nm ；采样频率：1.16 Hz, 增益:10 ；软件：OpenLAB CDS ChemStation Edition, Rev.C.01.03

试剂

甲醇(HPLC 级)，MilliQ 超纯水制备，标准品：黄曲霉毒素标准品(99%+B1:1.055 μg/mL,B2:0.327 μg/mL,G1:1.082 μg/mL， G2:0.309 μg/mL）溶解于甲苯/ 乙腈 (98:2)。

样品和标准品制备

玉米粉样品购买于本地超市。加标玉米粉样品: 样品前处理前向玉米粉中加入浓度4 的标准品（浓度数值见表1）。标准添加玉米粉样品：含有9.0 ppb B1和0.6 ppb B2；芝麻酱样品：含有4.57 ppb B1，其他三种浓度未知；酸枣仁样品。

标准溶液配制：取10 μl 标准品溶液置于10 ml 容量瓶中，室温下氮吹干，用甲醇- 水溶液（50:50,v:v）复溶，之后稀释成如表1 浓度。

样品处理：取5 种样品（见表2）和0.5 g 氯化钠置于50 ml 离心管中，加入25 ml 甲醇- 水溶液（70:30, v:v）高速匀浆1 min，离心5 min，取5 ml 上清液，加入15 ml 水，转移全部的20 ml溶液经免疫亲和小柱净化。

免疫亲和小柱净化过程：用2ml超纯水活化小柱；将要净化的样品加入到小柱上，流速1 滴/s ；超纯水清洗小柱，弃去洗脱液；用注射器向小柱打气10 s 以排干残液；1 滴/s 的速度加入甲醇0.5 ml 以使全部黄曲霉毒素被洗脱；收集全部洗脱液；向其中加入0.5 ml 超纯水，涡旋混匀；用0.22 μm 滤膜过滤。

结果和讨论

使用上述方法对四种黄曲霉毒素标准品（浓度4，蓝色）进行分析并与空白进样（红色）进行比较，见图1，根据色谱图可以看到四种黄曲霉毒素可以在13.5 min 内达到良好的基线分离，色谱峰有较大展宽，是由于样品经过衍生管时，流速较小，以便样品峰在管线中扩散。

峰面积和保留时间重现性对标准品（浓度4）峰面积及保留时间的重现性进行了6 次考察，结果显示保留时间RSD% 均小于0.15%，峰面积RSD% 均为0，峰面积重现性良好表明衍生效果稳定，定量结果可靠。见表3 。

检出限（LOD）和定量限（LOQ）用浓度1 与浓度2 的标准品分别进样以考察LOD 和LOQ，如图2，结果按信噪比折算，LOD 取S/N=3 的浓度，LOQ 取S/N=10 的浓度，表4 显示，此法的检出限与定量限可以完全满足国标GBT 18979-2003 的要求。

线性

对五个不同浓度的标准品（浓度级别2~6）进样分析以考察线性，如图3，4 种黄曲霉毒素的线性相关因子R 均大于0.999，结果见表5。

样品分析

回收率结果见表6，一致性良好证明基质不影响回收率，回收率值在55~75% 之间，比免疫亲和小柱说明书中报告的值（70~110%）略低。

图4 显示，未加标玉米粉样品中不含有黄曲霉毒素，在加标样品中，目标组分与基质干扰峰有良好的分离。加标玉米粉样品( 红色) 和标准添加玉米粉样品( 蓝色) 色谱图比较见图5（标准添加玉米粉样品：含有同时测定9.0 ppb B1和0.6 ppb B2）。含有四种黄曲霉毒素的芝麻酱样品色谱峰分离色谱图见图6。

图7 显示酸枣仁样品中不含有黄曲霉毒素。5 种样品的定量结果见表7，结果与确定含量样品的真实含量相吻合，表明此法定量结果可靠。

小结

本文使用柱后光衍生法HPLC 荧光法对黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2 进行同时测定。此法线性及重现性良好，可将被测成分与基质干扰峰分离，所需设备简单，在检出限和定量限上完全可以满足现行法规的要求。

责任编辑：展源

审　　核：何发