霉菌次生代谢产物的自动化高效检测

检测食物或饲料中的霉菌毒素，已成为常规检测之一，但整个分析过程自动化似乎并不常见。下面的这篇报道展示了自动化可以达到怎样的效率和程度。

图1.玉米、水稻、谷物这样的植物容易产生霉菌。

霉菌毒素是由霉菌或真菌产生的有毒有害物质，是霉菌的次生代谢产物。在植物上，包括谷物、饲草和青贮饲料均可发现霉菌毒素。目前已知污染 饲料的霉菌毒素有100多种，主要为青霉菌属、曲霉 菌属和镰刀菌属所产的多种霉菌毒素，其中对畜禽 危害较大的主要有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏马菌 素、呕吐毒素和玉米赤霉烯酮等。尽管它们对人体健康很少发生急性危害，但却可能导致癌症并破坏遗传因子。因此霉菌毒素的峰值受到严格的法定规律。

下萨克森州州政府的消费者权益保护与食品安全研究所规定，食品中不得添加霉菌毒素。但是霉菌的生长不可能被完全有效地制止，农产品在存储或处理的过程中很可能受到霉菌毒素的入侵。当用霉菌毒素污染过的谷物来喂养牲畜的话，霉菌毒素就有可能出现在牛奶、鸡蛋和肉制品中。

要知道，既然根据现行条例不能杜绝霉菌毒素的存在风险，那就应该采取适当的措施以尽可能地降低给消费者健康带来损害的风险。为了保护消费的健康，检测对霉菌毒素的仪器扮演了顶梁柱的角色。

图2. GERSTEL多功能取样器(MPS XL)是自动提取食物和饲料样品中霉菌毒素的装置。

美国GERSTEL公司的应用专家Oscar G.Gabrices博士说：“识别并定量检测食品、饲料中的霉菌毒素的重要手段就是将HPLC与MS/MS相结合。”

Cabrices博士与同事一起开发了HPLC-MS/MS检测法，包括对农产品基体中14种霉菌毒素从样品制备到检测的全自动化分析。将玉米或小麦样品与下列目标分析物混合并进行检测：黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2，赭曲霉毒素A，伏马菌素B1，二醋酸麃草镰刀菌烯醇，蛇形霉素，HT-2毒素，T-2毒素，玉米赤霉烯酮，呕吐毒素，3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇和镰刀菌烯酮-X。

应用专家Cabrices博士特别注重尽可能地提高样品制备的效率，“我们一直都致力于调整人力和技术的最佳投入比例，所以对于将人工操作发展为自动化操作很有兴趣”。为了达到这个目的，Cabrices博士和他的同事利用GERSTEL多功能取样器(MPS XL)，将很多必要的样品制备步骤完全自动化，来开发并实现多霉素的检测方法。

该MPS仪器有两个塔，这样可以不受干扰的处理不同体积的溶剂，并装配多种工具，比如，双位离心机(CF-100)，色散固相萃取即一次性吸管萃取(DPX)以及可将溶液和洗脱液漩涡搅拌并净化的可选配置。

样品制备是焦点

分析物的分离在HPLC系统Agilent 1200系列上进行， 它配了下列柱子： Phenomenex-Gemini柱，5µm，110埃，150×4.6mm，并使用溶剂梯度; 流动相是甲醇，水和乙酸的混合物(89:10:1至97:2：1)及5mM醋酸铵。多级质量检测采用AB SCIEX公司的QTRAP4500质谱仪。

Cabrices博士在成功完成方法开发后说，以本文的例子为例，此法中唯一需要人工手动执行的操作是，称量1g均化的粮食样品置入一个10ml的小瓶内，将小瓶密封并放入MPS样品盘上，剩下的所有操作步骤均由软件控制的MPS来完成,包括向小瓶中添加4ml乙腈-水的混合物(84:16); 将小瓶放入搅拌器并充分混合(1h，55℃，500 umin-1);离心分离;然后从上清液中为后续的DPX步骤取出500 µl。

图3. DPX技术示意图。

自动化程度最大化

Cabrices说:“DPX单元对于样品提取物的净化，以及对于整个样品的制备起着核心作用”。DPX由William E.Brewer博士在South Carolina大学发明，2001年申请了专利，并由GERSTEL公司实现了MPS进样器的自动化。“经典固相萃取中的固相被填充在一根柱子里的，”Cabrices博士说，在DPX中，固相被装在一个可移动的移液柱头内。“固相在这里是指DPX-Myco或DPXWax，与液体样品间的物质传递以4倍于之前的速度得以加快进行，所需的样品量也显著减少。萃取效率更多地取决于溶液和吸附剂之间达到平衡的时间，而不是由填充床的流速决定。”相比于经典固相萃取的柱子会发生堵塞的情况，Cabrices博士进一步强调了DPX的优势，DPX可以不受干扰地处理含有固体或粘稠的样品而不会发生堵塞。

当DPX完成任务后，MPS会自动将200 ml净化过的提取物放入预先准备好的2ml小瓶;洗脱液在MPS的mVAP蒸发器内被蒸发，残余物将溶解在500 ml的LC流动相中。这样得到的洗出液用于后继的HPLC-MS /MS法以测定霉菌毒素。

图4. 文中所述对富集霉菌毒素的玉米样品提取液(10ng/g)的分析色谱图。所有14个分析物均由本文所述的DPX-LC-MS / MS法测定。

有效地进行方法开发

Oscar Cabrices博士介绍说：“我们可以实现整个工作流程，即从样品制备到HPLC-MS /MS法检测的自动化，从而提高分析效率。”在开发检测霉菌毒素的方法时，他们很看重最大限度地提高效率，而如今这已经不是问题了。方法中DPX的应用结果表明，它只需用到很少的样品(500ml)，每个样品的萃取时间减少了5~9min。此外，该MPS的控制软件Maestro 可缩短用于HPLC-MS/ MS分析的样品的制备时间(预先准备功能)，这样就可以进一步节省时间。平均萃取率达到 70%以上，重复性好，RSD值<15%，该法标准直线的线性范围为2~500ng/L。

所用的LC / MS系统具有很好的的线性度， R²≥0.98，平均准确率≥88%。此外，所达到的定量检测下限低于欧盟委员会(EC)和美国食品和药物管理局(FDA)规定的水平。总而言之，Oscar Cabrices博士确信，他们的工作证明了霉菌毒素的测定可以相对简单地从人工操作过程完全转换为自动化过程。这位应用专家说 : “人工操作已成昨天。”

霉菌毒素是如何形成的?

霉菌毒素往往在特定的温度、湿度条件下以及有足够的营养物质时形成，如食品、谷物等在不适宜的贮存条件下过长时间的存放。而且所产生的往往不只是一种物质，而是化学性质相关的一系列化合物。霉菌毒素一般具有热稳定性，所以在食品加工过程中通常不易被破坏。