优化适度水解蛋白婴幼儿配方乳粉的检测方法。由于水解蛋白的水溶性，给多个检测项目带来了挑战，如样品前处理沉淀不完全、难以过滤、滤液混浊、色谱图中出现干扰峰，等等。本文分析了水解蛋白的特性，从样品前处理、色谱峰识别、色谱条件(流动相pH、浓度)、色谱柱冲洗等方面对以上项目检测方法的优化，展示了一些成功的例子，提供了一些解决方案。

　　乳是婴儿理想的天然食品，牛乳是婴儿首选的乳代品。牛乳虽然营养丰富，但它与母乳相比在蛋白组成上酪蛋白含量偏高，母乳中乳清蛋白含量为60%，酪蛋白含量为40%，而牛奶中酪蛋白含量占80%，乳清蛋白含量仅为20%。此外，其他营养成分如β乳球蛋白、β酪蛋白等含量存在差异。正是由于这些差异，导致了部分婴儿对配方乳粉的过敏反应。已有研究表明，高温高压、酶水解、糖基化反应等均能降低牛乳的过敏性，而适度水解蛋白是降低婴儿配方乳粉致敏性的最有效可行的方法，被推荐作为婴幼儿过敏预防的早期膳食干预方法。所以，水解蛋白配方乳粉已成为一种趋势。

　　目前，市面上已有不少水解蛋白配方乳粉出现，此类配方乳粉的检测需求也越来越大。由于适度水解蛋白为较小片段的蛋白或小分子多肽，与未酶解的大分子蛋白相比，其具有更好的水溶性。采用国标方法检测适度水解蛋白乳粉时，部分检测项目(主要是水溶性维生素)遇到了挑战，如样品沉淀蛋白后难以过滤，色谱图中出现干扰峰，等等。查询国内外文献，本文特针对这些问题，提出了一些解决方案。

　　样品前处理的优化

　　使用沉淀剂沉淀配方乳粉中的蛋白，并过滤除去(或离心分离)，是分析水溶性维生素或其余水溶性组分时除去蛋白干扰的主要方法。目前现行有效的国标方法中，测试项目维生素C、左旋肉碱、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、牛磺酸、胆碱、亚硝酸盐与硝酸盐、三聚氰胺均采用了此法。

　　但是，由于适度水解蛋白的存在，处理适度水解蛋白婴幼儿配方乳粉样品时，往往会出现沉淀不完全的现象，具体表现为沉淀稀松，成胶体状，在过滤样品溶液时，堵塞滤纸，过滤速度慢，滤液不澄清，有白色浑浊。

　　使用玻璃纤维滤纸(如Whatman 934 AH)，可有效解决这个难题。玻璃纤维滤纸各向同性好、孔径分布均匀，具有流速高，纳污能力强的特点，并可以过滤细小的颗粒。与其他的纤维材料和人工合成材料相比，玻璃纤维滤纸过滤效率更高，纳污能力更强。使用玻璃纤维滤纸后，可有效防止滤纸堵塞，维持较快的过滤速度，同时保持滤液澄清，避免干扰后续分析操作。

　　色谱峰识别的优化

　　测定分析适度水解蛋白婴幼儿配方乳粉样品时，由于适度水解蛋白的水溶性，在沉淀蛋白步骤中未被完全除去，残存的水解蛋白会与分析物一同注入色谱体系中进行检测分析，并作为杂峰被检出。部分杂峰的保留时间接近分析物，会影响分析物的保留行为，导致分析物主峰漂移，干扰分析物的定性，造成结果误判。因此，需要采取措施对色谱峰识别进行优化，确保定性的准确性。

　　加标定性

　　加标定性是一个简单易行的解决方案。在测试样品中加入相同水平的标准分析物，进样分析，比较加标前后分析物的峰面积变化比率是否与加标量相符，以此确保色谱峰识别的正确性。

　　峰纯度检测

　　检测过程中，有时杂峰与分析物保留时间完全重合，其表象为：色谱峰形正常，但加标后峰面积未同比增加，测试结果显著高于理论值。遇到此类情形，需考虑是否有某一杂质与分析物同时出峰。

　　此时，可采用峰纯度检测。使用二极管阵列检测器(DAD)全波长扫描色谱峰，如峰纯度低于阈值(一般可选0.990)，则该峰为混合峰，需要优化色谱分析条件以实现进一步分离，确保定量结果的准确性。

　　色谱峰分离的优化

　　测定分析适度水解蛋白婴幼儿配方乳粉样品时，一些杂峰与分析物保留时间相近，未实现基线分离，影响了分析物的定量，如维生素B6、牛磺酸、硝酸盐。此时，便需要优化色谱分析条件，提高定量准确度。

　　流动相pH优化

　　水溶性维生素多采用离子对试剂实现色谱分离，故流动相的pH将极大的影响分析物在色谱柱上的保留能力，影响出峰时间。

　　利用分析物与干扰物电离能力的微小差异，通过调整流动相的pH，可改变分析物与干扰物的相对保留时间，实现基线分离，提高定量的准确度。

　　如使用国标GB5009.169—2016 《食品安全国家标准食品中牛磺酸的测定》第二法丹磺酰氯柱前衍生法分析测定适度水解蛋白婴幼儿配方乳粉中的牛磺酸。未作调整前，分析物有杂峰干扰，主峰无分离度，基线也有漂移，强制垂直切分，无法确保结果的准确度，如图1所示。

　　只调整流动相pH，由4.2降为4.1，杂峰保留时间延长，与分析物牛磺酸实现了基线分离，基线也相对平缓，分离度为2.11，定量结果准确度改善，如图2所示。

　　流动相浓度优化

　　离子色谱法是利用被测物质的离子性进行分离和检测的液相色谱法。离子色谱淋洗液的浓度是影响分析物保留时间的重要因素。调整淋洗液浓度，将实现反相液相色谱中调整有机相比例同样的效果，改变分析物与干扰物的相对保留时间，实现分离的目的。

　　如国标GB5009.33—2016 《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》第一法离子色谱法测定适度水解蛋白婴幼儿配方乳粉中的硝酸盐。优化前，分析物与杂峰未基线分离，强制垂直切分后定量结果不准确，如图3所示。

　　调整淋洗液浓度，由5 mmol/L 13 min, 11 mmol/L 9 min, 50 mmol/L 5 min, 5 mmol/L 7 min改为5 mmol/L 13 min, 9 mmol/L 9 min, 50 mmol/L 5 min, 5 mmol/L 7 min，降低了中间KOH淋洗液浓度，杂峰保留时间延后，与主峰硝酸盐实现了基线分离，分离度达到了1.83，提高了定量准确度，如图4所示。

　　色谱柱冲洗

　　由于适度水解蛋白婴幼儿配方乳粉样品基质的复杂性，在进行色谱分析时，分析物主峰之后可能还有大量的杂质峰。它们的保留能力各不相同，有些杂峰可能具有极强的保留能力，如果色谱运行时间没有足够长，其可能在下一针中出峰，影响样品定量。因此，需确保色谱运行足够时间，或提高有机相浓度，保证高保留物质的洗脱。

　　如国标GB 5009.89-2016 《食品安全国家标准食品中烟酸和烟酰胺的测定》第二法高效液相色谱法测定适度水解蛋白婴幼儿配方乳粉中的烟酸和烟酰胺，未优化前，前一针样品的高保留物质与下一针样品中的烟酰胺一同出峰，严重干扰了定量的准确性，如图5所示。

　　在分析物主峰出峰后，增大有机相甲醇比例，同时延长色谱运行时间，冲洗出杂质峰，再恢复初始流动相并平衡，解决了杂峰干扰，如图6所示。

　　结论

　　本文分析了适度水解蛋白婴幼儿配方乳粉样品测试分析时遇到的困难和挑战，并依据不同问题提供了解决方案和思路，重点介绍了液相色谱分析时通过小幅调整流动相pH、浓度等，优化分析测试结果的准确性。