高效液相色谱仪色谱柱在色谱分析系统中主要起着分离检测物质的作用，如同色谱系统的心脏，同时也是易损耗品。

　　色谱柱在吸附样品时，样品中所含有的盐、脂质、疏水蛋白质和其它一些生物物质都有可能与色谱柱发生相互作用，一些保留值较小的物质如盐类比较容易被冲出色谱柱，而一些保留性较强的组分，流动相溶液不足以把这些物质洗脱下来，多次上样后，这些吸附在柱子表面的物质通常就会积累在柱头。

　　当这些被吸附的样品成分累积到一定程度足以使之形成新的固定相而改变分离机理，以致样品保留时间会波动，会出现拖尾现象。

　　色谱柱结构

　　1-塑料保护堵头;2-柱头螺丝;3-刃环(卡套);4-聚四氟乙烯O形圈;5-多孔不锈钢烧结片;6-色谱柱管;7-液相色谱固定相

　　色谱柱保护

　　为了延长色谱柱的使用寿命，前面已经指出，应在分析柱前连接一个小体积的保护柱。保护柱是内径为1.0mm、2.1mm、3.2mm、4.6mm或10mm、20mm、40mm，长7.5mm、10mm或20～60mm的短填充柱，通常填充和分析柱相同的填料(固定相)，可看作是分析柱的缩短形式，安装在分析柱前。

　　其作用是收集、阻断来自进样器的机械和化学杂质，以保护和延长分析柱的使用寿命。一只1cm长的保护柱就能提供充分的保护作用。若选用较长的保护柱，可降低污染物进入分析柱的机会，但会引起谱带扩张。因此选择保护柱的原则是在满足分离要求的前提下，尽可能选择对分离样品保留低的短保护柱。

　　保护柱也可装填和分析柱不同的填料，如较粗颗粒的硅胶(10～15um)或聚合物填料，但柱体积不宜过大，以降低柱外效应的影响。

　　保护柱装填的填料较少，价格较低，其为消耗品，通常可分析50～100次样品，柱压力降呈现增大的趋向就是需要更换保护柱的信号。

　　现在市场供应的结构新颖可更换柱芯式设计的保护柱，由保护柱套和可更换式保护柱芯两部分组成。

保护柱与分析柱的连接示意图

　　1-保护柱套;2-保护柱芯;3-PEEK标准通用接头;4-分析柱接头;5-连接六通进样阀接头

　　对硅胶基体的键合固定相，流动相的pH值应保持在2.5～7.0之间。具有极端值的流动相会溶解硅胶，而使键合相流失。

　　使用水溶性流动相时，为防止微生物繁殖引起柱阻塞，应加入0.01%的叠氮化钠，以抑制微生物的繁殖。对不洁净的样品，要使用0.45um滤膜过滤或经固相萃取器净化后再进样。

　　进行正式分析前，应先用10倍柱体积的流动相冲洗色谱柱，以保持色谱柱处于平衡状态。当使用乙醇、异丙醇、乙酸等黏度大的流动相时，色谱柱的平衡时间要延长，甚至要加倍。

　　对反相C18 键合相柱，除去柱中含有的缓冲溶液盐类或水溶性物质时，不应使用纯水冲洗。因为C18键合相像一条长链将硅胶黏结，当有有机溶剂存在时，其表面被流动相润湿，C18长链完全展开，像海水中的海藻一样。当纯水或缓冲溶液通过时，C18键合相与其不浸润，键合相表面会塌陷，从而将溶剂、样品分子或无机盐分子包合。此时仅用纯水无法将包合物洗脱出，应使用含5%有机溶剂的水溶液冲洗，才可清除无机盐或水溶性物质。

　　硅胶、氧化铝或正相键合相柱，应保存在流动相中。氰基柱不能保存在纯有机溶剂(如甲醇或乙腈)中，应保留在欲使用的流动相中;氨基柱最好保存在乙腈中，而非流动相，并且应注意不可使用丙酮作流动相。C18反相柱应保存在纯甲醇溶剂中，对填充高交联度苯乙烯-二乙烯基苯共聚微球的非极性固定相也可用此法保存。

　　色谱柱再生

　　对使用时间较长、柱效逐渐下降的色谱柱，可用下述方法进行快速再生，以除去微量不洁杂质在柱头的聚积。

　　正相柱：用下述极性强且能互溶的有机溶剂来洗涤色谱柱，每种溶剂每次用30mL清洗，按庚烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮(氨基柱不用)、甲醇、5%甲醇水溶液次序冲洗(洗脱剂的极性依次递增)，最后再用纯甲醇通过柱将水分带出，拆下柱置于气相色谱仪柱箱中升温至75℃，以除去水分。另应注意不能使用乙醇，它会使柱丧失柱效。

　　反相柱：用极性溶剂每种30mL，按以下顺序清洗：5%甲醇水溶液、0.5mol/L H3PO4(或0.1mol/L EDTA钠盐)、5%甲醇水溶液、甲醇、甲醇-氯仿(1：1)混合液、甲醇、5%甲醇水溶液。最后保存在甲醇溶剂中。

　　当色谱柱的性能变得很差时，可采用下述两种方法，作最后的补救。

　　一种方法是修补柱头并同时更换不锈钢烧结片。当取下烧结片发现柱头塌陷或填料被杂质污染时，可挖掉0.5mm左右的固定相，再重新填充同样的干燥固定相，用少量流动相润湿，再填充干燥的固定相与柱口平齐(必要时用光滑的不锈钢棒压紧)，如此重复3～5次。

　　再换上新的不锈钢烧结过滤片，拧紧结头，与高压泵连接，用流动相冲洗20min，若柱压力降恢复正常，可连接检测器，测柱效。若柱效恢复就可继续使用。若柱压力降恢复正常，但柱效仍偏低，表明柱头未填充紧密，仍有空隙，此时应重复上述操作，直至柱压力降恢复正常、柱效也恢复正常才可继续使用。

　　另一种方法是倒冲色谱柱。此法适用于已修补过柱头，柱寿命已达中后期的色谱柱。柱逆向使用后柱效会损失较大(约30%)，倒冲柱可检查柱头不锈钢烧结片是否堵塞。若已堵塞在倒冲柱时，可观察到柱压力降减小，待柱压力降恢复正常，再将色谱柱按原方向安装使用。

　　柱的使用和维护注意事项

　　色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。

　　在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。

　　1、避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况;柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓。

　　2、应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然，流动相使用前必须经脱气和过滤处理。

　　3、一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。

　　4、选择使用适宜的流动相(尤其是pH)，以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解，压力升高是需要更换预柱的信号。

　　5、避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处 理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以而且应该经常更换。

　　6、经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要50～75ml。

　　7、避免使用高粘度的溶剂作为流动相;如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净。

　　8、进样样品要提纯;

　　9、严格控制进样量，不要超载。

　　10、每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱，最好用洗脱能力强的洗脱液冲洗，例如ODS柱宜用甲醇冲洗至基线平衡。当采用盐缓冲溶液作流动相时，使用完后应用无盐流动相冲洗。含卤族元素(氟、氯、溴)的化合物可能会腐蚀不锈钢管道，不宜长期与之接触。装在HPLC仪上柱子如不经常使用，应每隔4~5天开机冲洗15分钟。

　　11、大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2-7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围。

　　12、按说明书保存色谱柱，绝对禁止讲缓冲液留在柱内过夜，注意反相柱不能用纯水长时间冲。

　　13、不建议拆开柱子，自己更换填料。