芍药汤出自《素问病机气宜保命集》[1],由芍药、当归、黄连、黄芩、槟榔、木香、甘草、大黄、肉桂等9味中药组成,具有清热燥湿、调和气血的功效,主治湿热痢疾。芍药汤为治疗溃疡性结肠炎的常用方剂[2],但目前对其有效成分及质量标准研究较少,仅有报道对其所含芍药苷的含量进行测定[3]。黄连、黄芩为方中君药[1],黄连有效成分为小檗碱,因此,本研究将盐酸小檗碱作为该复方的主要有效成分,建立了高效液相色谱(HPLC)法测定芍药汤中盐酸小檗碱含量的方法。结果表明,该方法简便、准确,重复性好,为芍药汤的质量控制提供了依据。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪：Agilent HPLC 1100色谱仪(G1311A四元泵,G1313A自动进样器,G1316A柱温箱,G1315B DAD检测器,HP化学工作站);Sartorius CP 225D电子天平。
盐酸小檗碱标准品(中国药品生物制品检定所提供,批号110713- 200910,供含量测定用);方中所用药材均购自北京丰泰金源药业有限公司,并由中国中医科学院中药研究所胡世林研究员鉴定,均为2005年版《中华人民共和国药典》(一部)收载的正品。乙腈(色谱纯,Fisher 公司);其他试剂为分析纯;水为娃哈哈纯净水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Agilent XDB C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾水溶液-三乙胺(30∶70∶0.14);流速：1.0 mL/min;柱温：25 ℃;检测波长：345 nm。
2.2 方药的提取
按处方称取各味中药,放入煎煮器中,采用传统水煎方法提取2次,加水量分别为6、4倍,每次煎煮30 min,合并煎煮液,浓缩,真空干燥成干膏粉,备用。
2.3 对照品溶液的制备
精密称取盐酸小檗碱对照品适量,加盐酸-甲醇溶液(1∶100)制成每1 mL含70 μg的溶液,即得。
2.4 供试品溶液的制备
取芍药汤干膏粉(过4号筛)约50 mg,精密称定,精密加入盐酸-甲醇溶液(1∶100)30 mL,称定重量,超声提取(功率250 W,频率40 kHz)30 min,放冷,再称定重量,用盐酸-甲醇溶液补足减失的重量,摇匀,过滤。滤液浓缩后移置10 mL量瓶中,用盐酸-甲醇溶液稀释至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,取续滤液,即得。
2.5 线性关系考察
精密吸取上述对照品溶液1、3、5、7、9、11、20 μL进样分析,测定峰面积。以进样量对峰面积积分值进行回归处理,得回归方程：Y=2 513.5X-32.56,r=0.999 9,盐酸小檗碱在0.07～1.40 μg呈良好的线性关系。
2.6 精密度试验
精密吸取同一份供试品溶液5 μL,按上述色谱条件进行分析,重复进样6次,峰面积RSD=0.33%,表明仪器精密度良好。
2.7 稳定性试验
取供试品溶液1份,室温放置,分别于0、1、2、3、4、5、6 h进样5 μL,按上述色谱条件进行分析,其峰面积RSD=0.61%,表明供试品溶液在6 h内稳定性良好。
2.8 重复性试验
按“2.4”项下方法制备供试品溶液6份,分别吸取5 μL,按上述色谱条件进行分析,测定峰面积并计算含量,结果供试品中盐酸小檗碱平均含量为1.55%,RSD=1.14%。表明重复性良好。
2.9 加样回收率试验
采用加样回收法。取已知含量的芍药汤干膏粉约50 mg(约含盐酸小檗碱0.775 mg),精密称定,共取6份,分别精密加入盐酸小檗碱对照品溶液(0.194 mg/mL)4 mL,按“2.4”项下方法制备供试品溶液,分别吸取5 μL,按上述色谱条件进行分析,测定峰面积并计算含量,结果平均回收率为98.63%,RSD=1.21%。见表1。表1 加样回收率试验结果(略)
2.10 样品测定
精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL,注入液相色谱仪,测定峰面积,计算供试品中盐酸小檗碱的含量。色谱图见图1;含量测定结果见表2。表2 样品测定结果(略)
3 讨论
本研究对芍药汤供试品的制备方法进行了优选,采取水煎液、水煎液蒸干甲醇溶解、水煎液制成干膏粉甲醇超声提取3种方法制备样品,结果表明,采用水煎液制成干膏粉甲醇超声提取方法制成的供试品溶液中盐酸小檗碱的百分含量明显高于其他方法。
本研究对仪器分离条件进行了优选。对盐酸小檗碱进行紫外全波长扫描,发现在250、280、340 nm左右有3个吸收峰值,选取254、280、340、345、350 nm进行检测,发现在345 nm波长处盐酸小檗碱的峰面积均大于其他波长,故选择345 nm作为检测波长。在色谱柱的选择上,我们选用Agilent SB C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Agilent XDB C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Agilent Extend C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)进行测定,结果表明,Agilent XDB C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱在峰形、塔板数、保留时间等方面均优于其他色谱柱。本研究还对流动相与柱温进行了筛选,流动相选择了乙腈-0.2 mol/L磷酸二氢钾水溶液(25∶75)、乙腈-0.033 mol/L磷酸二氢钾水溶液(30∶70)、乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾水溶液(30∶70)、乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾水溶液-三乙胺(30∶70∶0.14)、乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾水溶液(每1 000 mL水溶液加SDS 1.7 g)(30∶70)进行试验,结果显示,乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾水溶液-三乙胺(30∶70∶0.14)分离效果最优。在柱温上本实用选择了25、35 ℃进行比较,最后选择柱温25 ℃进行分离。
我们对提取溶媒进行了筛选,比较了水、75%乙醇、95%乙醇、甲醇、盐酸-甲醇(1∶100),结果盐酸-甲醇 (1∶100)作为溶媒时盐酸小檗碱含量明显高于其他溶媒。在对提取溶媒用量、提取方法与提取时间进行筛选上,采用冷浸、回流、超声波法,经过优选,采用盐酸-甲醇(1∶100)30 mL超声提取0.5 h作为样品的提取条件。
【参考文献】
[1] 李 冀.方剂学[M].北京：中国中医药出版社,2006.131.
[2] 赵晓霞,郭 胜,李宝鹤,等.芍药汤对溃疡性结肠炎大鼠ICAM-1、TNF-α、IL-10影响的实验研究[J].中国中医药科技,2008,15(3)：174.
[3] 魏玉明.高效液相色谱法测定芍药汤中芍药苷的含量[J].中医药学刊, 2005,23(12)：2272.
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