郁李仁为蔷薇科植物欧李Prunus humilis Bge.、郁李 Prunus japonica Thunb.或长柄扁桃Prunus pedunculata Maxim.的干燥成熟种子,前二者习称“小李仁”,后者习称“大李仁”,具有润燥滑肠、下气、利水的功效[1]。苦杏仁苷为郁李仁的主要成分之一,2005年版《中华人民共和国药典》在该药材含量测定项下采用银量法测定,但银量法属于间接测定方法,影响因素多,而目前采用其他方法对郁李仁进行含量测定的报道较少。笔者采用高效液相色谱(HPLC)法直接测定郁李仁中苦杏仁苷的含量,方法准确、可靠,为郁李仁中苦杏仁苷的含量测定提供了依据和参考。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Waters 515泵高效液相色谱仪,Waters 2487紫外检测器,ZW色谱柱,恒温箱(中国科学院大连化物所),Empower色谱工作站,Agilent手动进样器(20 μL);十万分之一电子分析天平(BP- 211D型,德国Sartorius);Cary50紫外分光光度计(美国瓦里安)。
1.2 试药
苦杏仁苷对照品(中国药品生物制品检定所,批号110820- 200403);郁李仁药材购自安徽亳州药材市场,经鉴定分别为蔷薇科植物郁李和长柄扁桃的干燥成熟种子。乙腈为色谱纯,水为超纯水,其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Supelco ODS C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相：甲醇-水(20∶80);柱温：25 ℃;流速：1.0 mL/min;检测波长：210 nm,进样量：20 μL。色谱图见图1。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取经五氧化二磷减压干燥12 h的苦杏仁苷对照品42.32 mg,置10 mL量瓶中,用70%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得苦杏仁苷4.232 mg/mL的对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
取郁李仁粗粉0.3 g,精密称定,置具塞三角烧瓶中,加石油醚(60～90 ℃)50 mL,回流提取1 h,过滤,以石油醚分3次洗涤滤渣及容器,每次10 mL,弃去石油醚液,滤纸及滤渣挥干溶剂,置原容器中,精密加入70%甲醇溶液50 mL,精密称定,回流提取1 h,放冷至室温,再称重,用70%甲醇补足失重,抽滤,精密量取续滤液5 mL置10 mL量瓶中,以70%甲醇稀释至刻度,以0.45 μm滤膜滤过,取续滤液即得。
2.4 线性关系考察
精密量取苦杏仁苷对照品溶液1 mL置10 mL量瓶中,用70%甲醇稀释至刻度,再依次稀释,制得含苦杏仁苷211.6、105.8、52.9、26.45、13.225、6.612 5、3.306 25 μg/mL的对照品溶液。分别精密吸取各20 μL进样测定,以峰面积积分值对浓度进行回归分析,得苦杏仁苷回归方程为：Y=22 645X+10 860,r=1.000 0;苦杏仁苷线性范围为0.066 13～4.232 μg。
2.5 精密度试验
精密吸取同一供试品溶液重复进样6次,测得苦杏仁苷峰面积积分值的RSD=0.86%。
2.6 重复性试验
取同一批次样品6份,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,按照“2.1”项下色谱条件测定,结果苦杏仁苷的平均含量为3.16%,RSD=1.35%。
2.7 稳定性试验
取同一供试品溶液于配制后0、2、4、6、8、10、24 h测定,计算峰面积RSD=1.11%,表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.8 加样回收率试验
精密称取已知含量的同一批次(批号080121)郁李仁粉末6份,每份约0.15 g,脱脂后分别精密加入4.232 mg/mL的苦杏仁苷对照品溶液1 mL,依法制备供试品溶液并测定。结果见表1。表1 加样回收率试验结果(略)
2.9 样品含量测定
分别测定了小李仁、大李仁药材各3批,采用外标法计算苦杏仁苷的含量,结果符合要求。表2 样品中苦杏仁苷含量测定结果(略)
3 讨论
本研究试验了多种流动相比例和流速[2-6],采用甲醇-水(20∶80)作为流动相,苦杏仁苷峰能较好分离,且出峰时间适当;水相中加入缓冲盐或酸对测定结果无明显影响,故水相选择纯水;色谱柱柱温设定25、35、40 ℃对分析结果无明显影响,故柱温设为25 ℃。
由于郁李仁中含有大量的油脂,如不除去测定时易引起干扰,且连续测定含油脂样品还可能引起色谱柱柱效降低,故提取前应先脱脂;文献报道[7]和本次试验结果均表明石油醚脱脂效果优于乙醚,故选择石油醚作为脱脂溶剂。苦杏仁苷易被苦杏仁苷酶水解,故一般测定时采用甲醇为提取溶剂,但甲醇提取液直接进行测定时,苦杏仁苷峰前拖尾现象严重,改用70%甲醇为提取溶剂时,峰形有很大改善,理论塔板数增加近1倍。比较了不同时间回流和超声提取效果,结果回流1 h可将苦杏仁苷提取完全,效果优于超声提取。
2005年版《中华人民共和国药典》在郁李仁含量测定项下采用的是银量法,其原理是用硝酸银滴定苦杏仁苷水解产生的氢氰酸来计算含量,苦杏仁苷的水解程度对结果影响较大,且在判断滴定终点时不同操作人员之间存在较大误差;采用HPLC法可直接测定药材中苦杏仁苷含量,结果客观准确,方法可靠。
【参考文献】
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社,2005.144.
[2] 王友兰,李红兵,华玉琴.HPLC法测定桃仁中苦杏仁苷的含量[J].中国药师,2002,5(9)：550,556.
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[4] 袁 丹,胡 爽,毕开顺,等.桃仁药材质量评价法的研究[J].中国药学杂志,2003,38(1)：53-56.
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