有机磷农药是含有磷酰（P=O）或硫代磷酰基（P=S）的磷酸或膦酸衍生物，因为具有高效广谱、环境半衰期短、价格低廉等优势，是当今世界农药中最主要的类别之一，也是国内生产和使用最广泛的农药类别。有机磷农药会抑制乙酰胆碱酯酶的活性，对所有以胆碱酯酶为神经传导介质的生物都具有杀伤作用。低浓度的有机磷农药会使鱼类等水生动物慢性中毒，影响其生长和繁殖，高浓度的有机磷农药则会直接导致其死亡。因为容易获得，有机磷农药常被不法分子用于鱼塘投毒案件中，导致养殖鱼大量死亡，影响生产和经济秩序。快速准确地对鱼塘投毒案件水样中的有机磷农药进行检测，能够为案件侦破及法庭诉讼提供证据。

目前检测水样中的有机磷农药主要采用气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱联用法以及液相色谱-质谱联用法等。气相色谱法和气相色谱-质谱联用法在进样前需要使用液-液萃取、固相萃取等前处理方法对1 L水样中的有机磷农药进行提取富集，操作过程复杂，耗费时间长。液相色谱法和液相色谱-质谱联用法通常采用直接进样方式或者经固相萃取后进样，但是液相色谱法和液相色谱-质谱联用法对于有机磷的检出限较高。以上方法存在灵敏度低、检材用量大、操作复杂费时等问题，无法满足公安机关对鱼塘投毒案件水样中有机磷农药的检测需求。实验建立全自动在线顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）结合气相色谱-串联质谱技术（GC-MS/MS）检测鱼塘投毒案件水样中13种有机磷农药的方法，具有操作简单、检材用量少、灵敏度高等优点，能够满足公安机关对于鱼塘投毒案件水样中有机磷农药的检测需求。

仪器与试剂

仪器

气相色谱-三重四级杆串联质谱仪：GCMS-TQ8050 NX，日本Shimadzu公司；

DB-5ms色谱柱：30 m×0.25 mm×0.25 µm，美国Agilent公司；

PAL RSI全自动样品处理及进样系统（带顶空萃取模块）：瑞士CTC Analytics公司；

Milli-Q Direct纯水化仪： 德国Merck Millipore公司；

100 µm聚二甲基硅氧烷（PDMS）萃取纤维头：瑞士CTC Analytics公司。

试剂

敌敌畏、灭线磷、治螟磷、甲拌磷、特丁硫磷、地虫硫磷、二嗪磷、甲基对硫磷、马拉硫磷、毒死蜱、倍硫磷、对硫磷、杀扑磷标准样品（德国Dr. Ehrenstorfer公司，纯度≥98%）；

甲醇（美国Fisher Scientific公司，色谱纯）；

氯化钠（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）。

标准溶液配制

使用甲醇将敌敌畏、灭线磷、治螟磷、甲拌磷、特丁硫磷、地虫硫磷、二嗪磷、甲基对硫磷、马拉硫磷、毒死蜱、倍硫磷、对硫磷、杀扑磷标准品配置成质量浓度为1 mg/mL的单标准储备溶液，于-20 ℃保存。分别移取1.0 mL上述单标准储备溶液于50.0 mL容量瓶中，用甲醇定容配制成10 µg/mL的混合标准储备溶液，于-20 ℃保存。

标准工作溶液使用一级水逐级稀释成所需的质量浓度。

实验方法

1.气相色谱条件

色谱柱：DB-5 ms毛细色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 µm）；

载气：高纯氦气（99.999%），恒流模式，流速1.56 mL/min；

进样口温度：260 ℃；

不分流进样模式；

升温程序：初始温度60 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升至280 ℃，保持5 min。

2.质谱条件

电子轰击离子源（EI源）；

离子源温度200 ℃；

接口温度280 ℃；

溶剂延迟时间2 min；

扫描方式为多反应监测模式（Multiple Reaction Monitoring，MRM），扫描间隔0.1 s；

碰撞气为高纯氩气（99.999%）。

3.顶空固相微萃取条件

取2.0 mL水样于20 mL顶空瓶中，加入0.6 gNaCl，旋紧装有聚四氟乙烯/聚硅氧烷盖垫（PTFE/Silicone）的螺纹盖，放入样品盘中。使用100 µm PDMS萃取纤维头，设置PAL RSI全自动样品处理及进样系统参数，见表1。

结果与讨论

质谱条件优化

采用Q3Scan扫描方法分析10 μg/mL的13种有机磷农药的混合标准溶液，选择丰度高且质荷比大于100的特征离子作为母离子，分别筛选出13种目标物的母离子，设置碰撞能（CE）范围为3~45 eV，使用产物离子扫描方法进一步得到各目标物最佳CE电压以及离子丰度比值，建立MRM分析方法。13种有机磷农药的总离子流色谱图见图1，优化后的质谱参数见表2。

图1 13种有机磷农药的总离子流色谱图

萃取条件优化

根据MRM扫描方式下各待测物的仪器响应值，使用一级水稀释配制质量浓度分别为1 ng/mL的治螟磷、甲拌磷、毒死蜱、倍硫磷、特丁硫磷、地虫硫磷，10 ng/mL灭线磷、二嗪磷、对硫磷，50 ng/mL甲基对硫磷、敌敌畏、马拉硫磷、杀扑磷的混合工作溶液。在上述仪器条件下分别优化萃取温度、萃取时间、样品体积以及溶液的离子强度。

1.萃取温度优化

取1 mL工作溶液置于20 mL顶空瓶中。使用100 µm PDMS萃取纤维头，PAL RSI全自动样品处理及进样系统设置萃取时间为30 min，分别考察温度为45℃、60℃、75℃、90℃条件下的萃取效果。不同萃取温度条件下13种有机磷农药的峰面积见图2。绝大多数有机磷农药的色谱峰面积随萃取温度升高而增大，因为升高温度可以增大扩散系数，加速有机磷的挥发，但是升温会导致分配系数降低，影响萃取纤维对目标物的吸附，降低萃取效率，温度过高也会导致甲拌磷分解。综合考虑后，选择75℃为萃取温度。

图2 萃取温度对萃取效果的影响

2.萃取时间优化

取1 mL工作溶液置于20 mL顶空瓶中。使用100 µmPDMS萃取纤维头，PAL  RSI全自动样品处理及进样系统设置萃取温度为75℃，分别考察萃取30 min、45 min、60 min、75 min、90 min时的萃取效果。不同萃取时间条件下13种有机磷农药的峰面积见图3。除二嗪磷外，其余有机磷的色谱峰面积在45~90 min范围内变化不大，表明萃取45 min时，有机磷在样品基质、顶空气体以及纤维涂层这三相中转移基本平衡。考虑到时间成本，选择萃取时间为45 min。

图3 萃取时间对萃取效果的影响

3.样品体积优化

分别取0.5 mL、1 mL、2 mL工作溶液置于20 mL顶空瓶中。使用100 µm PDMS萃取纤维头，PAL RSI全自动样品处理及进样系统设置萃取温度为75℃，萃取时间为45 min，不同样品体积下13种有机磷农药的峰面积见图4。在其他条件不变的情况下，样品体积增大，SPME的萃取相中样品绝对量增加，可以提高检测方法的灵敏度。但是当样品体积超过2 mL时，顶空萃取过程的剧烈振荡会导致萃取头接触到液体样品，减小萃取头的使用寿命。因此选择样品体积为2 mL。

图4 样品体积对萃取效果的影响

4.离子强度优化

取两份2 mL工作溶液分别置于20 mL顶空瓶中，一份中加入过量NaCl使溶液达到饱和状态。使用100 µm PDMS萃取纤维头，PAL RSI全自动样品处理及进样系统设置萃取温度为75 ℃，萃取时间为45 min，不同盐浓度条件下13种有机磷农药的峰面积见图5。加入过量NaCl使样品达到饱和状态后，可将样品间离子强度的差异降至最低，使有机磷农药在水溶液中的溶解度下降，分配系数增大，方法灵敏度提高。因此选择加入过量NaCl使样品达到饱和状态。

图5 离子强度对萃取效果的影响

方法学验证

1.线性关系、检出限和定量限

根据MRM扫描方式下各待测物的仪器响应值，用一级水稀释配制质量浓度分别为0.01、0.1、1、2、5、10、15、20 ng/mL灭线磷、治螟磷、特丁硫磷、地虫硫磷、二嗪磷、毒死蜱和0.05、0.1、1、10、20、50、100、200 ng/mL敌敌畏、甲拌磷、甲基对硫磷、马拉硫磷、倍硫磷、对硫磷、杀扑磷的混合标准工作溶液，按优化后的全自动在线顶空固相微萃取条件和仪器条件进行萃取分析。以3倍和10倍信噪比（S/N）计算各目标物的检出限和定量限，以各目标物的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果见表3，13种有机磷农药的检出限为0.002~0.5 ng/mL，定量限为0.006~1.8 ng/mL，且在线性范围内标准曲线的相关系数均大于0.99，线性关系良好。

2.精密度

根据MRM扫描方式下各待测物的仪器响应值，各目标物分别设置低、中、高三个浓度，每个浓度平行测定六个样品，按上述优化的萃取方法和仪器条件进行萃取分析，结果见表4。三种浓度下13种有机磷农药的精密度在1.92%~17.10%之间。样品在加热模块中升温并不断振荡进行萃取时，样品瓶壁可能会吸附部分目标物，尤其当基质中目标物浓度较低时，瓶壁的吸附作用会对精密度产生较大影响。

结束语

实验建立的全自动在线HS-SPME对于鱼塘水样中的有机磷农药具有良好的提取效果，13种有机磷农药在线性范围内线性关系良好，标准曲线相关系数（R2）＞0.99，方法检出限为0.002~0.5 ng/mL，定量限为0.006~1.8 ng/mL，精密度在1.92%~17.10%之间。方法仅需2 mL鱼塘水样品，无需使用有机溶剂，绿色环保，萃取步骤为程序设定的全自动化操作，平行性好，且萃取模块直接搭载在气质联用仪上方，样品处理完毕直接进样测试，整个过程不到1.5 h，且后续样品能智能计算萃取和进样时间，实现了前处理分析一体化的功能，为公安机关检测鱼塘水中的有机磷农药提供了参考。