DNA提取、含量及纯度的检测，这些细节你注意到了吗？
DNA
做DNA提取及含量测定是，你是否一次成功，有没有遇到过奇怪的问题，一起来看看前辈的经验总结，跟小析姐一起get技能，无惧实验！
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制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤,通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素,以保证DNA的完整性,为后续的实验打下基础。主要是CTAB方法,其他的方法有:1、物理方式:玻璃珠法,超声波法,研磨法,冻融法。2、化学方式:异硫氰酸胍法,碱裂解法3、生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等。下面介绍一下本实验室常用的几种方法。
苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂,反复抽提,使蛋白质变性,SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解,在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子,核蛋白变性降解,使DNA从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水,不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团,也容易进行水合作用,并在表面形成一层水化层,使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时,蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏,变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相),DNA存在于上层水相中,蛋白质则沉淀于两相之间。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在1/103mol/LNaCl存在下沉淀DNA,回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐,真空干燥,用TE缓冲液溶解DNA备用。
取枸橼酸钠抗凝外周血2ml加8ml 1×红细胞裂解液放在15ml离心管中,冰上放置30min,至溶液透明,3000rpm离心10min,去除上清。加1×红细胞裂解液4ml,充分混匀, ,3000rpm离心10min,去除上清,加100μl 20%SDS,加30μl 20mg/ml的蛋白酶k摇匀, 37℃摇床过夜(>8h)。加等体积饱和酚至上述样品处理液中,温和充分混匀,静置10分钟, 离心3000rpm×10min,取上层水相到另一1.5ml离心管中,加等体积饱和酚,混匀,离心3000rpm×10min,取上层水相到另一管中。加等体积酚/氯仿(1:1),轻轻混匀,离心3000rpm×10min,取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清,可重复此步骤数次。加等体积氯仿,轻轻混匀,离心3000rpm×10min 。取上层水相到另一管中, 加2倍体积的无水乙醇及少量生理盐水,轻轻倒置混匀。待絮状物出现后,离心12000rpm×10min,弃上清液。沉淀用75%乙醇洗涤,离心12000rpm×10min ,弃上清液。室温下挥发乙醇,待沉淀将近透明后加TE水溶解过夜。Nanodrop 核酸定量分析仪测定DNA浓度并记录,最后将所提DNA放置-20℃冻存。
一般真核细胞基因组DNA有107-109bp,可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取,常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞,随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析,还可用于PCR的模板、文库构建等实验。
根据材料来源不同,采取不同的材料处理方法,而后的DNA提取方法大体类似,但都应考虑以下两个原则:
（1）试剂准备:TE: 10mM Tris-HCl(pH7.8),1mM EDTA (pH8.0),TBS: 25mM Tris-HCl(pH7.4),200mMNaCl;5mMKCl,裂解缓冲液(250mMSDS,使用前加入蛋白酶K至100mg/ml),20%SDS,2mg/ml蛋白酶K,Tris饱和酚(pH8.0),酚/氯仿(酚∶氯仿=1∶1),无水乙醇,75%乙醇。
（2）新鲜或冰冻组织处理:取组织块0.3-0.5cm3(大约100g) 剪碎,加TE 0.5ml,转移到匀浆器中匀浆。将匀浆液转移到1.5ml离心管中。加20%SDS 25ml,蛋白酶K (2mg/ml)25ml,混匀。60°C水浴1-3小时(根据样本的情况可适当增加水浴时间)。
（3）提取DNA: 加等体积饱和酚至上述样品处理液中,充分混匀3min。离心5000g×10min,取上层水相到另一1.5ml离心管中。加等体积饱和酚,混匀,离心5000g×10min,取上层水相到另一管中。加等体积酚/氯仿,轻轻混匀,离心5000g×10min,取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清,可重复此步骤数次。加等体积氯仿,轻轻混匀,离心5000g×10min,取上层水相到另一管中。加1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇,轻轻倒置混匀。待絮状物出现后,离心5000g×5min,弃上清液。沉淀用75%乙醇洗涤,离心5000g×3min,弃上清液。室温下挥发乙醇,待沉淀将近透明后加50-100ulTE溶解过夜。
DNA提取试剂盒是适用于PCR研究的快速提取DNA的方法,与经典酚氯提取法相比,高效、快速的提取纯度较高的DNA,操作过程简单,无毒无味,所需样品材料的量较少;但价格较为昂贵,且产出DNA的量少。现今全血DNA提取试剂盒、细胞及组织DNA提取试剂盒等均已商品化,可在TIANGEN, 宝生物、QIAGEN等生物公司购买,其具体实验步骤参照试剂盒中提供的说明书操作,下面以唾液中DNA的制备为例,介绍DNA提取试剂盒(QIAamp Blood DNA Mini Kit)的使用步骤。
1、0.5 mL唾液以1 mL PBS缓冲液(pH 7.4)重悬,3000g离心5分钟,弃上清;
2、沉淀以200ml PBS缓冲液和20ml Protease重悬后,按QIAamp DNA Kit试剂盒使用要求制备DNA(洗脱体积50ml):加入200mL 裂解液AL,涡悬混合器处理15秒, 56℃ 水浴10min,离心机上甩一下, 加入200mL 无水乙醇,混匀, 转入spin cloumn中, 6000g离心 1min, 弃滤出液,柱子中加入500ml AW1, 6000g 离心1min, 弃滤出液,加入500ml AW2, 20000g 离心3min, 弃滤出液, 将柱子中溶液置于新1.5ml EP管中,加入50ul AE,室温或56℃静置1-3min, 再次6000g 离心1min 收获DNA。
一种方法是通过凝胶电泳的方法检测DNA的含量:取2-5μlDNA溶解液与0. 4μl 6×载样缓冲液混合,用0.75%琼脂糖凝胶(含EB0.5μg/ml)检测。溴化乙锭可迅速嵌于DNA双螺旋结构中,嵌入DNA中的溴化乙锭受紫外光激发而发出荧光,这种荧光强度与DNA总质量数成正比,通过比较样品与标准品的荧光强度,对样品中的DNA进行定量。(详见凝胶电泳)
另一方法是分光光度法,组成DNA的碱基,具有一定的吸收紫外线的特性,其最大吸收值在波长250-270nm之间。这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后,其吸收紫外线的特性没有改变,核酸的最大吸收波长为260nm,利用DNA的这个物理特性来测定DNA的浓度。同时可以检测280nm处紫外吸收值,当OD260/OD280的值在1.8-2.0之间时DNA纯度较好,排除蛋白等的污染,可用于PCR等DNA质量要求较高的实验。
1、取两只清洁的比色杯,各加入2ml 0.1mol/L TE校正零点。
2、以其中的一只比色杯作为空白对照,在另一只比色杯中加入4μlDNA溶液,再加入0.1mol/L TE至2ml混匀(V/V=1:8)。
3、测定波长为260nm时的OD值,再将波长调至280nm测其OD值。
4、根据OD260=1时,双链的DNA浓度为50μg/ml,单链DNA或RNA浓度为40μg/ml,按计算公式:样品DNA浓度(μg/ml)=OD260×40μg/ml×稀释倍数,计算样品的DNA浓度。
现今实验室使用nanodrop核酸定量分析仪检测DNA的含量和纯度,仅需 2μl DNA溶液便可检测出所需数据,并有紫外吸收图谱。
1、裂解液要预热,以抑制DNase,加速蛋白变性,促进DNA溶解。
2、酚一定要碱平衡,使用平衡饱和酚。苯酚具有高度腐蚀性,飞溅到皮肤、粘膜和眼睛会造成损伤,因此应注意防护。氯仿易燃、易爆、易挥发,具有神经毒作用,操作时应注意防护。
5、异丙醇,乙醇.NaAc,KAc等要预冷,以减少DNA的降解,促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。
6、提取DNA过程中所用到的试剂和器材要通过高压烤干等办法进行无核酸酶化处理。
8、用大口滴管或吸头操作,以尽量减少打断DNA的可能性。
9、要用新鲜样品或液氮冷冻-70度保存的样品。这样通过降低内切酶的活性DNA的降解。
11、吸取基因组DNA时,要用专用的粗口吸头,普通吸头可能会切断DNA或造成DNA缺口。
12、在准备实验的过程中,应将DNA样品放在碎冰上。
13、加缓冲液后,为了加速DNA溶解,可以轻轻晃动或轻弹试管。
14、加入缓冲液后,置于4度过夜,也可以溶解DNA。
15、将DNA溶液65度温育10分钟,可以灭活DNase。
16、在抽提过程中如果水相和有机层的界面不太清楚,说明其中蛋白质含量较高,可增加酚/氯仿抽提的次数或适当延长离心的时间。
17、酚抽提时如果上清液太粘稠,无法进行水相转移时,可加入适量TES稀释后再抽提。
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