抽丝剥茧：两起涉及HPLC的案件，一起来探案吧
在日常工作中，我们使用液相色谱进行分析检测过程中经常会遇到各种问题，比如压力波动、不出峰、漏液、基线飘了、保留时间变了、肩峰、倒峰……等等，面对这些好玩的“案件”你想知道结果吗？跟小析姐一起来探案吧。
案件一：可疑的肩峰
案情概述
这起案件的主角就是我们的WelView光化学衍生器，幸好遇到了严谨专业的客户，逐一排查可能的原因，才洗脱了光化学衍生器的“嫌疑”，想了解案情吗？且听老赵头娓娓道来。
案情复盘
WelView光化学衍生器是一款高效、便捷、耐用、方便的光化学衍生设备。在黄曲霉检测及磺胺类药物检测方面起了重要的作用。
光化学衍生器示意图
有用户做黄曲霉毒素检测时，走样出现了不常见的肩峰。嗯，黄曲霉毒素检测这是一个常规的应用，到底问题是什么呢？有图有真相！
咱虽然比不上柯南、福尔摩斯、狄仁杰，但也要帮助老师找出“真凶”呀，探案开始……
看图挺有意思吧，好久没看过这样奇怪的色谱图了，是什么原因导致的呢？
老赵头看到这张图，首先判断了这个问题跟光化学衍生过程没有太大联系，光化学衍生器是一个衍生装置，作用是增加待测物的响应，所有峰形都酱紫，还是建议用户先找找液相仪器和色谱柱的原因吧。
从色谱图上看所有的峰都有延迟的肩峰，考虑进样器问题的概率比较大，经过电话沟通，询问用户使用的仪器是手动进样还是自动进样，色谱柱使用情况，以及光化学衍生器连接情况等问题。
用户小姐姐陈述到“前几天刚用该色谱柱在未使用光化学衍生的情况下做了赭曲霉毒素，峰形良好，应该不是色谱柱和液相的问题。”
客户做赭曲霉毒素的时候仪器和色谱柱是状态良好的，做黄曲霉的时候色谱仪器和色谱柱的性能有可能发生了变化。哲学家赫拉克利特说过：“人不能两次踏进同一条河流”嘛。老赵头还是建议小姐姐简单快速地排查一下，更换一根色谱柱和一台液相仪器试试。
过了一天再次致电用户小姐姐询问情况，小姐姐说光化学衍生器没问题，用同一根柱子，换了一台液相使用之后，问题解决了，是液相仪器的问题！
至此，我们的WelView光化学衍生器就洗脱嫌疑了！用户小姐姐反馈结果如下图所示。
色谱条件：
仪器：Water2695（FLD2475）及光化学衍生器Welview；
色谱柱：Waters C18 （5μm，250×4.6）；
流动相：甲醇：水 45：55；
激发波长：360nm；
发射波长：440nm。
这个案子也就结束了，但是关于这个奇怪的现象我们要探究一下，出现这种峰的可能原因究竟是什么呢。
如果发现所有的出峰都是肩峰，其中一个原因可能是色谱柱出了问题。柱头塌陷柱头污染柱头堵塞不溶性颗粒，如下图所示：
案件二：抽丝剥茧，探查鬼峰来源
我们刚刚为光化学衍生器洗脱嫌疑，又接到装机小哥哥反馈，装机现场出现鬼峰，到底是什么情况呢？
案件概述：
事情还是要从我们的工程师小哥哥接到派工单说起，他八百里加急赶赴客户现场安装Wisys5000液相色谱仪。
前期还是很顺利的，机器安装完毕后，给客户做了验收测试，整机各项性能良好，顺利通关。应客户要求用客户的样品和方法做测试，这时候问题出现了，在进完对照品后，进客户的样品，再进对照时，出现了鬼峰，上图，有图有真相。
样品含量测定色谱条件：
色谱柱：月旭Ultimate® XB-C18，
4.6×250mm，5μm
检测波长：230nm
流动相：A0.1%磷酸溶液：B乙腈
A：B =14：86
第一组序列进样谱图结果：
对照品谱图
样品谱图
进样后再进对照品的谱图
第二组序列进样谱图结果：
对照品谱图
样品谱图
进样后再进对照品的谱图
第三组序列进样谱图结果：
对照品谱图
样品谱图
进样后再进对照品的谱图
从上面的色谱图可以看出，空白进样之后，进对照品，再跑完样品后继续进对照品。这时，主峰之后会出现一个鼓包。这个鼓包出现的时间还“乱窜”，有时21.8min，32.2min，或者23.1min，不一定！这个鼓包就是我们要探的案情所在！经小编分析，可能造成鼓包的原因一般来说有以下几种：
● 流动相污染引入的鬼峰包括使用的水、有机溶剂、盐类、容器、滤膜等
● 流动相中的气泡
● 电压不稳造成的基线波动
● 进样器污染引入的鬼峰
● 检测器流通池污染引入的鬼峰
● 色谱柱污染
案件排查：
我们逐一来排查一下，首先针对流动相污染，如果是流动相被污染的情况，在平衡系统跑基线阶段也会有所体现，空白也会有鬼峰，但是现在基线和空白以及对照品都非常良好，所以说这种可能排除，偷偷告诉你，假如真的是流动相有鬼峰可以使用鬼峰补集小柱来解决这一问题。
鬼峰补集小柱
鬼峰补集小柱安装位置是泵混合器之后进样口之前，故而可以解决流动相中鬼峰的干扰，而又不会对样品有吸附，导致保留时间和含量发生变化，影响我们的分析结果，是个非常Nice的小工具。
针对流动相中有气泡这一问题，重新配置了流动相，然后过滤&超声脱气再上机还是存在这个问题，而且我们的wisys5000有内置脱气机，加之系统整体性能验证是没问题的，脱气机完好，从而排除了气泡的可能。在这里我们要多说一句，好多客户小伙伴在做等度分析时，习惯性的用泵来混合，且不说四元低压和二元高压混合精度的问题，单是纯水或者纯盐、纯乙腈夏天长时间放置对实验结果的影响，纯水相长菌，堵系统堵柱子不说，pH也会改变，影响对pH敏感的分析，另外乙腈有可能会聚合导致我们泵的单向阀宝石球被黏连，不能正常工作。小细节也很值得注意噢，别等出了问题开偏差调查。
对于电压不稳的问题，我们的工程师小哥哥在装机之前会测量客户现场电压以及确认接地情况，经过反复确认，实验室电压稳定，这个可能性也排除。
针对进样器可能存在污染的风险，我们的工程师小哥哥在后面两天的测试中，分别在进样前后加了多次洗针，鬼峰依然存在，由此判断污染不是进样阀及进样针外壁残留。
对于检测污染排查也比较方便，重新平衡系统及走空白均无鬼峰出现，这个可能性也排除了。
最后我们排查色谱柱了，由于客户运行时间是40min，样品在38min左右时还是有峰的，可能后续有其他组分在设定的运行时间内没有被洗脱下来。类似的情况比较常见，排查时延长运行时间即可。
我们的安装工程师将运行时间改为80min后，重新运行序列，问题解决，样品后再进对照品，已无鬼峰出现。
案件总结：
这次问题又顺利解决，客户签字，结案！有的小伙伴可能会说首先就排查样品和方法问题了，嗯很优秀经验丰富。但是如果“编剧”上来就把反派写的Be了，导演还咋拍呢。经过严肃认真的思考，其他原因纯属为了凑字数。真相大白。
（内容来源：月旭科技 由小析姐整理编辑）
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