七步走！帮你快速了解DNA纯化磁珠
DNA
磁珠纯化
磁珠是高通量测序过程必备产品，通过磁颗粒活性基团在一定条件下可与核酸结合和解离的原理，将样本中目的片段分离。可实现对核酸样本的高通量自动化操作，广泛应用于基因测序以及分子诊断领域。
磁珠是高通量测序过程必备产品，通过磁颗粒活性基团在一定条件下可与核酸结合和解离的原理，将样本中目的片段分离。可实现对核酸样本的高通量自动化操作，广泛应用于基因测序以及分子诊断领域。
背景篇
磁珠的发明构想最初来自于挪威科技大学的化学家John Ugelstad，他在1976年以聚苯乙烯为主要材料，制作出均匀磁化的球体粒子。1979年Vogelstein等报道在高浓度碘化钠存在的条件下，玻璃粉末作为吸附剂用于从琼脂糖凝胶中提取DNA片段，而后基于硅胶和其他具有亲水性表面载体的固相核酸纯化技术广泛发展起来。而基于磁性微粒的核酸纯化方法就是其中的一种。
虽然到目前为止纳米级别的磁珠各式各样，表面性质不同，分离的原理也不尽相同，但其材料组成和基本的结构并无太大的差异。基础结构分为三层，最内层的是聚苯乙烯，第二层包裹磁性物质（通常是Fe3O4），最外层是修饰的官能团（如羧基）。其中官能团能与核酸结合，表面基团不同，下游的应用也不尽相同，如核酸提取，纯化，生物素捕获等。
图1. 磁珠结构示意图
商业化磁珠产品体系一般包含：磁珠、聚乙二醇（PEG）、盐离子等。基于SPRI(Solid Phase Reversible Immobilization )技术， DNA在一定浓度的PEG存在条件下，NaCl或MgCl2促进条件下，DNA分子构象会发生急剧变化，会暴露出磷酸骨架上大量的带负电荷的磷酸基团，与表面带负电荷的羧基磁珠结合。目前认为这种负负电荷间的作用是由于带正电荷的盐离子的作用（如Na+）。带负电磷酸基团借由解离的盐离子（如Na+）与羧基形成离子桥，使DNA被特异性吸附到羧基磁珠表面。利用磁珠的磁性，可通过外加磁场进行收集洗脱。
图2. 磁珠吸附DNA原理示意图
受益于高通量测序技术的发展，磁珠也凭借其高通量，适用于自动化的特点备受推崇，广泛用于NGS文库构建中DNA纯化/双轮分选（片筛）。DNA纯化的目的在于去除不想要的片段，由于磁珠优先吸附大片段，因而可通过一定比例的磁珠吸附特定大小以上的片段，丢弃上清（去除非目标片段）后将磁珠吸附的DNA洗脱回收。常用于小片段如接头二聚体/引物二聚体的去除。
图3. DNA纯化操作示意图
DNA双轮分选（片筛）目的在于从片段化DNA中选择特定区域的DNA片段大小。由于磁珠优先吸附大片段，因而需通过两轮磁珠操作进行分选。以分选450-550 bp的片段范围为例：首先第一轮磁珠吸附550 bp以上片段，此时弃磁珠留上清，则上清中片段为550 bp以下的片段。第二轮取磁珠吸附450 bp以上（550 bp以下）磁珠，此时弃上清，再将磁珠上的目的片段洗脱回收。常用于NGS文库构建片段分选（片筛）。
图4. DNA双轮分选操作示意图
1. 磁珠回收效率DNA样本经磁珠纯化后会有部分样本的损失，磁珠回收效率可评估磁珠的回收能力。具体可通过计算得出：回收效率=（纯化后的DNA质量/Input DNA质量）×100%。以下表为例，相同的比例条件下：测试人1测试A样本回收效率=153.25/169.5=90.41%，同理可计算其他样本的回收效率。
表1. 磁珠回收效率计算
【注】：磁珠测试数据来源于上海某生物公司, 表格中A为AMPure XP磁珠；B、C、D分别是翊圣磁珠三个不同批次。
2. 磁珠分选精度由于二代测序段短读长的局限性，因而最终的NGS文库需满足一定的长度要求。因而NGS建库中可能会分选特定长度区间的片段，满足上机需求。分选精度则是评估不同的磁珠投入比例分选得到的片段大小。一般以Agilent 2100仪器检测。在特定磁珠比例（0.45×/0.15×）条件下，不同样本分选后片段分布范围集中在同一位置。较好的分选效果图应该是顶部窄而圆润的独峰。
【注】：数据结果来源于上海某生物公司。值得注意的是：不同厂家磁珠buffer的不同，导致相同比例条件下分选得到的片段范围也不一致，使用前请按照对应的磁珠说明书选择合适的分选比例进行操作。
1.磁珠使用前需平衡至室温，否则影响实验效果（PEG分离效果易受pH、温度等影响）；
3. 长度分选时建议初始体积≥100 μL，不足时请用超纯水补齐（样品体积太小，将导致移液误差增大，进而影响分选的准确性）；
4. 磁珠分选时特别注意第一轮分选后弃含大片段的磁珠，第二轮弃含小片段的上清；
5. 第一轮分选转移上清时，避免吸到磁珠，引起大片段残留；
6. 分选/纯化产物如需长时间存放请用TE buffer洗脱保存。
看起来很简单的纯化/分选实验，却在实际实验中有各种意外的情况。那关于产品选择以及使用方面我们实际操作中有什么需要注意的事项呢？
产品应用
1. 磁珠可以吸附ssDNA吗？A：可以回收单链DNA，具体性能没有测试过。附图是Beckman磁珠回收单链DNA的数据，可以作为参考。
2. 分选磁珠可以纯化gDNA吗？A:翊圣分选磁珠测试过最大20kb的片段，回收率>90%。基因组 DNA 未测试过，测试时，由于大DNA与磁珠结合的非常紧，建议尽量增加洗脱液体积，避免干燥时间过久。
3. 磁珠的DNA结合能力怎么样？A：在目前的磁珠体系中，磁珠的吸附能力均为过饱和，客户不必担心磁珠结合能力不足的情况。根据已知的报道，每1 μL磁珠可以结合7 μg DNA。
4. 使用磁珠吸附小片段的时候，大片段也会吸附上来吗？A: 磁珠优先吸附大片段，增大磁珠投入量时，磁珠会在吸附大片段的基础上增强吸附小片段的能力。举例说明：参考磁珠纯化分选表，100 μL样本，加入80 μL磁珠Cat#12601,此时磁珠上吸附的是>350 bp的片段，但是，当磁珠投入量至100 μL时，磁珠上吸附的是>200 bp的片段。
产品使用效果
1.使用磁珠分选/纯化之后，还有小片段残留是怎么回事？
A:小片段残留大部分是接头二聚体/引物二聚体。若纯化，降低磁珠比例；若分选：可适当降低二轮磁珠比例可有效改善此类情况。
1）磁珠与DNA混匀不充分，未能充分吸附。建议反应体系充分混匀；
2）磁珠比例不对，建议按照说明书进行选择合适的比例；
4）磁珠分选时，二轮磁珠吸附的时候吸到磁珠。可在200 μL 枪头前串联 10μL枪头用于移液，可防止吸到磁珠；
5）磁珠洗涤时的乙醇非现配，导致乙醇浓度过低，建议乙醇浓度不低于70%；
6）干燥过度：磁珠长时间干燥导致表面龟裂，DNA难以洗脱，得率降低；建议干燥时间不宜过长，表面刚出现龟裂即可；
7）洗脱液体积不足：最终洗脱液应完全覆盖管内磁珠。
产品储存
1. 磁珠不小心放在低温（-20℃）冻了一段时间，还能用吗？
A：不能使用，低温会破坏磁珠表面集团的修饰，影响磁珠回收性能。
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