实验过程中核酸降解的预防手段与方法

展源 0 2023-03-13

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核酸降解

在实验过程中，最心累的莫过于好不容易提取的核酸却降解了。那么核酸为什么会发生降解呢，我们又该如何预防呢？关于核酸降解，你了解多少呢？让我们一起对核酸降解一探究竟吧。

什么是核酸

核酸是一种高分子化合物，核苷酸是构成核酸的基本单位。核酸水解后得到许多核苷酸，核苷酸是组成核酸的基本单位，即组成核酸分子的单体。

一个核苷酸分子是由一分子含氮的碱基、一分子五碳糖和一分子磷酸组成的。根据五碳糖的不同可以将核苷酸分为脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。如果5-碳糖是核糖，则形成的聚合物是RNA；如果5-碳糖是脱氧核糖，则形成的聚合物是DNA。

核酸降解本质

核酸降解是DNA/RNA分子中的碱基和戊糖间的氮糖苷键，或磷酸二酯键在物理因素、化学因素和生物因素等作用下发生水解，使DNA/RNA链发生断裂。

核苷磷酸化酶：能分解核苷生成含氨碱基和戊糖的磷酸酯酶。广泛存在于生物体内,催化的反应可逆。可在核苷水解酶作用下继续分解核苷成嘌呤碱、嘧啶碱和戊糖。

核苷水解酶：主要存在于植物和微生物体内，只水解核糖核苷。

核酸降解原因

DNA降解的因素很多，主要分为物理因素，化学因素和生物因素。

一、物理因素：温度，机械剪切力、核酸的反复冻融、高温煮沸及辐射等。

二、化学因素：PH值，水解反应，氧化反应等。

三、生物因素：酶解及微生物侵染等作用。

一、物理因素的影响

★ 温度：高温条件下，RNA不稳定，易加速磷酸二酯键的水解，使核酸降解；

★ 机械剪切力：包括剧烈震荡、搅拌、细胞突然至于低渗溶液中，以及让溶液快速通过狭长的孔道；

★ 核酸的反复冻融、高温煮沸及辐射等，均会导致核酸的降解。

二、化学因素影响水解

★ PH值：氢离子参与催化磷酸二酯键、糖苷键的水解，但糖苷键比磷酸二酯键更易被酸水解。过高或过低的PH值都易破坏复键。核酸(特别是RNA)在碱性溶液中十分容易降解；

★ 氧化反应：会氧化碱基中的含氨杂环，使其变性，从而改变一级与二级的核酸构象；

★ 苯酚在空气中被氧化生成醌，它能够产生自由基，直接用于DNA的分离，会使磷酸酯键断裂，造成DNA的降解。

三、生物因素影响

★ 酶解：核酸酶可以催化水解多聚核苷酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构，使其降解。

1.核酸酶(磷酸二酯酶)

核酸内切酶：在环境或生物体内具有识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶统称为限制性核酸内切酶。作用方式从多聚核苷酸链中间开始，在某一个位点切断磷酸二酯键。如DNase，RNase等。

核酸外切酶：核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端(3'-端或5'-端)开始，逐个水解切除核苷酸。如蛇毒磷酸二酯酶，牛脾磷酸二酯酶等。

2.核苷酸酶(磷酸单酯酶)

专一性的磷酸单酯酶：3'-核苷酸酶，5'-核苷酸酶

非专一性磷酸单酯酶。

★ 微生物侵染：微生物会将DNA作为营养物质或是其分泌的化学物质含酶。

预防降解的方法

预防RNA降解的方法:

★ 去除环境中RNase酶的污染或强有力地抑制其活性。

★ 获取样品后最好立即提取RNA，若无条件立即实验，应于-80℃液氮中保存样品，提取时取出样品后立即在低温下研磨裂解细胞，以防RNA降解。

★ 在总RNA提取分离的最初阶段，联合使用Rnase的特异抑制剂，尽可能的灭活胞内的Rnase的活性。

★ 避免样品的反复冻融。

★ 保证裂解液的质量，裂解液的用量不足，也会导致RNA降解。

★ RNA提取后，放入-80℃保存，防止降解。

预防DNA降解的方法:

★ 简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏；

★ 减少化学物质对DNA的降解，为避免过酸、过碱对DNA双链中磷酸二酯键的破坏；

★ 防止基因组DNA的生物降解，主要是DNase降解基因组DNA，Dnase需要二价金属阳离子Mg2+等的激活，可用EDTA等金属离子整合剂整合Mg2+以抑制Dnase的活性；

★ 减少物理因素对DNA的降解，物理降解因素主要包括机械剪切力(如剧烈震荡、搅拌等)；

★ 避免样品的反复冻融，可将DNA分装保存于缓存液中；

★ 所有试剂应用无菌水配制，耗材经高温灭菌；

★ 避免DNA的过高温处理等。

内容来源： Super Lab

责任编辑：展源

审　　核：何发

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