试剂、进样瓶、色谱柱等选择不对，实验结果能准确？

展源 0 2023-05-04

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试剂、进样瓶、色谱柱

当下，市面上实验室试剂和耗材琳琅满目，质量、价格等也是参差不齐，究竟什么样的试剂与耗材才是对保证实验结果准确无误的呢？作为实验人员又应该如何选择呢？

首先，就是方法的适用性，不同的实验方法，选择不同的试剂与耗材，这是选择的前提，其次，就要考虑质量和价格，我们后说质量与价格，不是说他们不重要，而这是一个先后的顺序，三者同样重要，少考虑了哪一样都将是不明智的选择。

化学试剂的选用

化学试剂是进行化学研究、成分分析的相对标准物质，是科技进步的重要条件，广泛用于物质的合成、分离、定性和定量分析。在工厂、学校、医院和研究所的日常工作中，都离不开化学试剂。

首先，我们要了解实验的化学试剂的分类。

国标试剂分类介绍

该类试剂为我国国家标准所规定，适用于检验、鉴定、检测。

试剂级（RG，红标签）：作为试剂的标准化学品。

基准试剂（JZ，绿标签）：作为基准物质，标定标准溶液。

优级纯（GR，绿标签）：主成分含量很高、纯度很高，适用于精确分析和研究工作，有的可作为基准物质。

分析纯（AR，红标签）：主成分含量很高、纯度较高，干扰杂质很低，适用于工业分析及化学实验。

化学纯（CP，蓝标签）：主成分含量高、纯度较高，存在干扰杂质，适用于化学实验和合成制备。

实验纯（LR，黄标签）：主成分含量高，纯度较差，杂质含量不做选择，只适用于一般化学实验和合成制备。

教学试剂：可以满足学生教学目的，不至于造成化学反应现象偏差的一类试剂。

指定级（ZD）：该类试剂是按照用户要求的质量控制指标，为特定用户订做的化学试剂。

高纯试剂（EP）：包括超纯、特纯、高纯、光谱纯，配制标准溶液。此类试剂质量注重的是在特定方法分析过程中可能引起分析结果偏差，并对成分分析或含量分析产生干扰的杂质含量，但对主含量不做很高要求。

色谱纯（GC）：气相色谱分析专用。质量指标注重干扰气相色谱峰的杂质。主成分含量高。

色谱纯（LC）：液相色谱分析标准物质。质量指标注重干扰液相色谱峰的杂质。主成分含量高。

指示剂（ID）：配制指示溶液用。质量指标为变色范围和变色敏感程度。可替代CP，也适用于有机合成用。

生化试剂（BR）：配制生物化学检验试液和生化合成。质量指标注重生物活性杂质。可替代指示剂，可用于有机合成。

生物染色剂（BS）：配制微生物标本染色液。质量指标注重生物活性杂质。可替代指示剂，可用于有机合成。

光谱纯（SP）：用于光谱分析。分别适用于分光光度计标准品、原子吸收光谱标准品、原子发射光谱标准品。

合成试剂：就是在标明成分主含量的前提下，严格给出该产品的有关各种物理常数的一类化学试剂。

其次，我们必须考虑试剂的具体用途。

化学试剂的选用应以分析要求为主，包括分析任务、分析方法、对结果准确等为依据，来选用不同等级的试剂。如痕量分析要选用高纯或优级纯试剂，以降低空白值和避免杂质干扰。在以大量酸碱进行样品处理时，其酸碱也应选择优级化学纯。同时，对所用的纯水的制取方法和玻璃仪器的洗涤方式也应有特殊要求。作仲裁分析也常选用优级纯、分析纯试剂。一般车间控制分析，选用分析纯、化学纯试剂。某些制备实验、冷却浴或加热的药品，可选用工业品。

不同分析方法对试剂有不同要求。如络合滴定，最好用分析纯试剂和去离子水，否则因试剂后水中的杂质金属离子封闭指示剂，使滴定终点难以观察。

另一方面，GC-MS，HPLC，UPLC和 LC-MS等应用，需要特定的或高度纯化的溶剂级别，以满足痕量分析的严格性能要求。这样也保证用户得到最高的仪器灵敏度，同时避免因使用低质量溶剂导致仪器中有残留引起的停机清洗。使用高质量溶剂的好处还包括减少重复工作、提高精密度和准确度、提高仪器性能、增加重现性以及减少仪器配件和提高分析效率等。尽管这些高纯度溶剂的成本会比低级别的产品稍高，但这些成本可以从上述好处中得到抵消。

以下是几种常见的实验室化学试剂用途：

1、HPLC级高纯液相色谱溶剂

优点：

低紫外吸收
非挥发性物质、游离酸、游离碱和水份含量低
可用于荧光检测

用途：用于液相色谱（LC）样品制备、LC样品分析、LC-MS分析

2、农残级试剂

优点：

极低的农残背景值（≤5 pg/ml ），不挥发性组分极少
GC控制（ECD-PND检测）质量可靠，稳定性高
适用于分析有机氯农药、有机磷农药、多氯联苯
（PCBs）及其他用GC/ECD和GC/PND检测的化合物
符合各种杀虫剂残留量分析的要求和对低挥发性杂质的要求

用途：用于气相色谱检测（ECD、PND），用于有机氯、有机磷农药，PCBs及其他用GC/ECD和GC/PND检测的化合物。

3、光谱纯试剂

优点：

低紫外吸收、低红外吸收
杂质含量低
适用于UV、IR光谱分析

用途：用于UV、IR光谱分析

4、优级纯试剂

符合国际标准要求，金属元素杂质含量低（大多是ppm级）。

用途：优级纯试剂可用于大多数常规实验，这类产品还可应用于生产领域。

5、特纯与合成试剂

特纯（extra pure）或者合成（for synthesis）级别试剂的质量标准能够满足实验室常规溶液的配置或标准化生产使用（药物合成原材料等），通常只检测一些重要应用的参数，比如，纯度、IR参数、水分含量和醚含量以及过氧化物成分。

6、NMR核磁共振溶剂

氘代溶剂广泛应用于化学研究领域，对于分析有机物分子结构的重要方法－－核磁共振波谱法是不可缺少。

用途：核磁共振实验可以提供原子同其他分子中的原子的关联信息，包括分子的空间取向、三维空间结构。在蛋白质组学、染色体组学、药物研究领域有广泛的应用。

对氘代溶剂有哪些要求？

NMR对所用溶剂的氘代度反应很敏感，如用200兆赫光谱，使用氘代度在99.5％～99.8％就足够了，如果提高设备的等级，例如用600兆赫光谱，则需要更高氘代度的溶剂。

7、基准试剂

基准化合物必须是测试精度范围内的纯物质；基准溶液被用于检验和校准当量溶液、pH缓冲溶液；只有这样的物质才能反映检验测定当量溶液。

8、衍生化试剂

衍生法指借助化学反应将待测组份接上某种特定基团，从而改善其检测灵敏度和分离效果的方法。利用化学衍生反应达到改变化合物特性的目的，使其更适合于特定分析的过程，在仪器分析中被广泛应用。

气相色谱用：为了增加样品的挥发度或提高检测灵敏度；

高效液相色谱用：与样品组份进行化学反应，反应的产物有利于色谱检测或分离。

紫外光谱用：使被测化合物带上特定基团，具有紫外吸收。

红外光谱用：使被测化合物键合特定基团，具有红外吸收。

荧光检测用：带上荧光发色基团。

最后，综合考量质量与价格。

虽然化学试剂必须按照国家标准进行检验合格后才能出厂销售，但不同厂家原料和工业生产的试剂在性能上有时有显著差异。甚至同一厂家，不同的同一类试剂，其性质也很难完全一致，因此，在某些要求较高的分析中，不仅要考虑试剂的等级，还应注意生产厂家、生产批号等。

说完了实验室试剂的选取办法，接下来咱们再聊一聊如何选取实验室耗材，因为实验室耗材众多，只选取其中几个常见的实验室耗材。

固相萃取柱的选择

关于萃取柱使用时的常见问题，一般有回收率低、重现性差、净化效果不佳、流速过快过慢这几大方面，下面我们一一说明：

1、回收率低

原因分析:

（1）目标物在填料上保留不足

判断方法:空白溶剂加标，回收上样液和淋洗液，若实际检测浓度超过含量的5%，说明保留不足。

可能原因	对策
SPE柱选择不合适	选择更强保留的SPE柱
样品上样液或淋洗液的洗脱强度过强	降低样品上样液或者淋洗液的洗脱强度
上样体积/浓度过高，导致过载发生	减少上样浓度或者增加填料量
操作过程中，小柱发生“干涸”现象	重新进行活化/平衡，保证小柱在淋洗结束前不能发生“干涸”现象

（2）目标洗脱不完全

判断方法:空白溶剂加标，回收上样液和淋洗液，没有检出目标物;但回收洗脱液，回收率也不高。

可能原因	对策
小柱保留太强	选择保留稍弱的SPE柱
洗脱能力太强	增强洗脱强度
洗脱体积太小	增强洗脱体积

（3）其他原因

判断方法：空白溶剂加标，回收上样液，淋洗液没有检出目标物;回收洗脱液，回收率正常。

可能原因	对策
预处理的提取不足	改变提取溶剂
目标物质不稳定，挥发或者分解	改变提取和转移方式，减少加热温度，受PH影响较大的化合物可加入缓冲盐调节PH等
预处理过程复杂	简化预处理过程
目标物与杂质结合	换适当的方法除杂质
杂质干扰效应太强	改变前处理方法或与基质加标物质进行对比
杂质过多，超出小柱最高保留	改变预处理方法，减少上样量或增加小柱填料量

2、重现性差的原因及对策

可能原因	对策
操作步骤繁琐，人为误差导致	改变前处理方法或者制定SOP方法
复杂样品基质除杂效果不佳	改变整个前处理方法，加入内标或与基质加标数据做对比
上样过程发生干涸	重新活化平衡
发生堵柱现象或者流速过快	前者改变预处理方法，后者使用止回阀控制流速

3、净化效果不佳的对策

①改变预处理方法

②改变淋洗液和洗脱液的强度

③选择合适的作用小柱

④正确进行SPE操作

4、流速过快过慢的原因及对策

流速过慢的原因	对策
SPE选择的粒径过小	选择大粒径SPE
样品预处理后仍有悬浮不溶物	上样前冷冻离心
样品粘度太高	样品稀释
SPE阻力过大，液体无法靠重力滴落	使用手动固相萃取柱装置，通过调节止回阀，气门，抽负压来调节流速
流速过快的原因	对策
SPE选择的粒径过大	选择小粒径的SPE
重力作用时流速依然很快	使用手动SPE装置，调节止回阀
抽负压时流速过快	调节止回阀和气门，控制真空表压力恒定在一定范围内

所以，选择合适的萃取柱对检测结果的准确性有着至关重要的作用。一般从两方面进行考量：吸附剂和柱规格。适宜的吸附填料可以让干扰物质与目标组分得到良好的分离，并满足回收要求。而吸附剂所能吸附的化合物质量是有限的，一旦样品量过大，则会出现“超载”，使得目标物直接“穿透”萃取柱不被保留。

根据基质性质选择

吸附剂主要可根据目标化合物性质和基质性质进行选择。

吸附剂的选择则大致可由以上两种方式进行选择，对于具体实例，可依据“区分目标化合物和主要干扰物”的原则进行选择。

基质	目标化合物	主要干扰物	萃取柱
土壤、污水	疏水性有机污染物	腐殖物质	反相柱C18、SLC
水果、蔬菜、中药、果汁、蔬菜汁、果酒	多种农药残留	碳水化合物、色素、有机酸、酚	NH2、Carbon/NH2
弱极性农药	反相柱C18
碱性农药	阳离子交换柱HLB
酸性农药	阴离子交换住PAX
血液、尿液、动物组织、奶制品	中性、弱酸性、弱碱性药物	蛋白质、脂肪	反相柱C18、SLC
碱性药物	阳离子交换柱PCX
酸性药物	阴离子交换住PAX
油脂	脂溶性维生素、磷脂、黄曲霉毒素	脂肪	正相柱silica、NH2、PSA

选择出适宜的吸附剂后，还需要根据检定所需的样品量选择合适的柱规格。由于萃取柱的吸附剂能吸附的化合物质量是有限的，一旦超过了这个数值，目标物就不能被有效保留，使得洗脱效果大打折扣。因此，根据样品中的组份量选择合适的柱规格，是很有必要的。

以下给出了萃取柱的上样容量及洗脱参数，以供参考:

萃取柱规格	最大上样量	最小洗脱体积
50mg	2.5mg	125μL
100mg	5mg	250μL
150mg	7.5mg	375μL
200mg	10mg	500μL
500mg	25mg	1250μL
1000mg	50mg	2500μL

液相色谱柱的选择

选择色谱柱时应考虑不同色谱柱参数的影响，以下内容对色谱柱的参数进行分析。

HPLC色谱分离模式的选择

在建立化合物的HPLC方法时，可以首先根据化合物的分子量大小，极性大小及PKa，选择合适的分离模式，在适当的分离模式下去再去优化同类的色谱柱及流动相。化合物分子量<2000Da时，按下图来选择。

化合物分子量>2000Da时：

在实际工作中所涉及的化合物绝大部分都可以使用反相色谱进行分离，下面先分析反相键合相色谱柱性能的影响因素，只有了解影响色谱柱性能的因素，才能结合目标分析物的性质、需要达到的分析效果及实验室条件来选择适合的色谱柱。

影响色谱柱性能的物理参数

1、硅胶纯度

硅胶纯度和残留金属离子浓度，硅胶的杂质会影响化合物的峰形，硅胶表面的金属含量高会影响碱性化合物的峰形，易发生拖尾。

2、色谱柱尺寸

填料床的长度和内径，增加色谱柱长度，可以在一定程度上提高柱效，但也会升高压力和导致峰展宽；宽柱径，提高载样量，但也会增加横向扩散，同样会导致峰展宽。窄柱径可以节约溶剂，可减少横向扩散，但压力较大，对系统要求较高。

3、颗粒形状及粒径

球形颗粒柱效高、重现性好、柱床结构均匀，不规则形柱床结构不均匀、流动相线速度不均匀，容易谱带展宽；平均颗粒直径，粒径越小，柱效越高，柱压也越高。粒径分布越广则柱效越低，压力越大。

4、颗粒表面积

颗粒外表面和内部孔表面的总和，以m2/g表示，相对而言高表面积对样品具有较强的保留能力，更大的柱容量和分离度。而低表面积能更快达到平衡状态，更适合梯度洗脱程序。

5、孔径

颗粒的孔或腔的平均尺寸，范围是80~3000，大孔径的填料颗粒可以延长大分子溶质在填料表面的滞留时间，改善分离，所以大孔径填料适合分离大分子化合物或者水动力体积较大的分子。

影响色谱柱性能的化学因素

1、键合类型及键合相

键合相分子与基体单点相连为单体键合，这种键合方式可以提高传质速率，缩短柱平衡时间；聚合体键合为键合相分子与基体多点相连，这种键合方式可以增加色谱柱稳定性，增加载样量。而键合相不同会直接影响化合物的保留行为。

2、碳覆盖率

高碳覆盖率可以提高分辨率和重现性，但分析时间长。

3、封端

硅胶键合相填料中有部分未封端的残留硅羟基，如图封端可以减轻待测组分与硅胶表面残留的酸性硅羟基反应，改善保留和峰行，这对于碱性化合物尤其重要。而不同的封端技术也会直接影响色谱柱的效能。

反相键合相色谱柱的选择

1、重现国标文献中方法

选择色谱柱粒径、比表面积、基质表面特性、键合类型等相似的色谱柱，或者利用USP网站及一些色谱柱选择软件，如“column selector for acd/chemsketch”来查询相似系数，选择相似系数高的色谱柱。

2、建立新化合物分离分析方法的色谱柱选择

根据目标分析物的分子量大小、溶解性、Pka值，以及分离要求、仪器、成本等各方面来选择色谱柱。

(1) 根据分离目的选色谱柱，对映体分离常选择手性柱，离子化色谱可选择离子柱，蛋白多肽、DNA可选择凝胶柱或离子交换柱，一般的小分子化合物可选择普通反相柱，如C18、C8柱、苯基柱等等。

(2) 根据实际需求和设备选择填料粒径，普通HPLC一般选择5μm或3.5μm粒径的色谱柱，而UPLC则常使用1.7μm—3.5μm的色谱柱。

(3) 比表面积，高比表面积有助于分离，低比表面积更适合梯度洗脱程序。

(4) 孔径，大分子化合物适合大孔径，在保证比表面积的前提下，选择孔径大的。

(5) 键合相的选择

直链烷基键合相C18和C8适合中等极性化合物，对于极性化合物可以选用硅羟基未封端或特殊封端的C18柱；或者键入极性基团的C18柱；

下表是常见的化学键合相及其运用范围：

现在商品化的液相色谱柱琳琅满目，根据色谱柱的参数可以给我们提供一个初步的选择，但由于各个仪器厂商的填料技术和键合技术都有差异，即使是C18柱，同一品牌不同系列都有不同的功能，有能耐受低PH值的、耐受高温、耐受纯水相和适合碱性分离等等。所以在使用色谱柱之前需要好好阅读产品说明手册，才能找到满意的分离条件。

样品瓶和隔垫的选择

样品瓶质量的重要性

如果不严格控制公差，自动进样器样品瓶的标示尺寸及壁重可能有所不同，这会影响样品瓶中的样品容积，龙其对少量样品来说非常重要，我们严格的公差控制贯穿于整个制造过程中，从最初设计到最后的光电扫描检查过程，确保每一个样品瓶和瓶盖规格的准确性。

在自动进样器上使用劣质样品瓶和密封件的害处：

常见问题	影响
样品瓶底部厚度不一致	抽取样品不一致；损坏注射针头
自动进样器序列停止	错抓或掉了样品瓶；珍贵样品的损失
密封泄露检测不到	样品损失、挥发；可能污染样品
移位或定位不准的隔垫	样品损失；样品污染
鬼峰	瓶盖隔垫的污染

隔垫质量的重要性

防了防止污染，避免针头和仪器损坏，正确的隔垫选择是至关重要的，在选择时应该注意的问题：

1、温度控制

在较高温度下隔垫会发生降解而导致样品污染，橡胶隔垫仅在90℃以下稳定，因此不适用于高温应用。通常以聚四氟乙烯和优质硅橡胶或者超纯硅胶作为材料的隔垫是用于各种温度的最佳选择。

2、碎屑

当针头直径相对隔垫太大或隔垫材料不能承受多次进样时就会产生碎屑，此时，隔垫材料会脱落进入样品瓶并污染样品。以下是如何防止碎屑的方法：

a. 选择一种PTFE内衬的隔垫以防止隔垫材料进入样品中；

b. 确保针头未损坏，考虑使用侧孔针头替代锥形针头；

c. 使用预穿孔隔垫几乎可以完全消除碎屑。

d. 对于高敏感性样品，推荐使用聚四氟乙烯（PTFE）隔垫，因为PTFE层可作为一种耐化学腐蚀的屏障。

3、再密封性

再密封性是选择隔垫需考虑的一个重要因素。PTFE/红色橡胶隔垫不推荐用于多次进样或需要储存用于以后分析的样品。当进样之间需要较长时间或添加任何类型的标样时，PTFE/硅橡胶/PTFE总是最佳选择。

4、易刺穿性

通常，硅橡胶隔垫比红色橡胶和丁基橡胶隔垫更易穿刺。预穿孔隔垫是最佳选择，最易穿刺并能减少碎屑的可能。

5、瓶盖和隔垫兼容性

瓶盖和隔垫兼容性
	PTFE/硅橡胶	PTFE/硅橡胶/PTFE	PTFE/红色橡胶
温度范围	-40℃-200℃	-40℃-200℃	-40℃-90℃
用于多次进样	是	是	不能
价格	经济	昂贵	非常经济
耐穿性	优异	优异	无
推荐用于样品储存	是	是	不能
最适用于	大多数常用HPLC和GC分析，耐穿性不如P/S/P	卓越性能满足超痕量分析，重复进样及内标需求	氯硅烷，单次进样更经济的选择

6、隔垫与样品和溶剂的兼容性

隔垫化学兼容性
	PTFE	PTFE/硅橡胶	PTFE/硅橡胶/PTFE	PTFE/红色橡胶
乙腈	√	√	√	√
烃类（己烷、庚烷、甲烷）	√		√	√
甲醇	√	√	√	√
苯	√		√
四氢呋喃	√		√
甲苯	√		√
二甲基甲酰胺（DMF）	√	√	√
二甲基亚砜（DMSO）	√	√	√
乙醚	√	√	√
氯代溶剂（二氯甲烷）	√		√
乙醇	√	√	√	√
乙酸	√	√	√
丙酮	√	√	√
苯酚	√	√	√
环己烷	√		√	√

*PTFE/硅橡胶/PTFE隔垫与PTFE隔垫具有相同的化学兼容性，直至被刺穿

一次性针式过滤器

选择不同种类的针式过滤器对流动相及样品进行过滤达到澄清除菌、去除杂质颗粒的作用。对保护色谱系统及色谱柱具有重要意义。

针式滤器的选择主要可以从以下三个方面进行考量：外壳、规格，以及滤膜。

1、外壳

一般外壳为高压聚丙烯（PP），耐高温，不泄漏，不需换膜和清洗，省去繁杂费时的准备工作，是过滤HPLC、GC小量样品首选产品。

2、规格

直径：常用Φ13mm、Φ25mm、Φ33mm三种。即样品量2-10ml选用Φ13μm，样品量10-100ml选用Φ25μm，大于100ml选用Φ33μm。

孔径：0.22μm、0.45μm

3、滤膜的特性及应用

（1）水系膜（混合纤维素酯CN-CA）

特性：孔径均匀、孔隙率高、无介质脱落、质地薄、阻力小、滤速快、成本低，但不耐有机溶液及强酸强碱。

应用：饮用水、地表水、井水等除菌过滤溶液中微粒及油类不溶物的分析、水质污染指数测定、气体、油类、饮料、酒等微粒和细菌过滤。为前处理过滤中最为广泛使用的滤膜之一。

（2）尼龙膜（聚酰胺NYLON）

特性：耐温性能好、可耐121°C、饱和蒸汽高压消毒30分钟、最高工作温度60°C，化学稳定性好，能耐稀酸稀碱等多种有机无机化合物、溶剂。

应用：适用于电子、微电子、半导体工业水过滤组织培养基、药液、饮料、高纯化学品、水及有机溶液流动相的过滤。

（3）PVDF膜（聚偏氟乙烯）

特性：膜机械强度高、抗张强度好、具有良好的耐热性及化学稳定性、蛋白吸附极低、具较强的疏水性。

应用：气体及蒸汽过滤、高温液体过滤、组织培养基、添加剂等除菌过滤、溶剂和化学原料净化过滤。

（4）PTFE（聚四氟乙烯）

特性：具有广泛的化学兼容性、耐温性好、抗强酸强碱、化学腐蚀性较强的溶剂及氧化剂。

应用：化工、医药、环保、电子、食品、能源等领域，几乎能过滤所有的有机溶液。

内容来源：食品仪器分析

责任编辑：展源

审　　核：何发