尤其近年来为提升检验方法的灵敏度和便捷性，采用HPLC检测的项目越来越多，液相小瓶在试验过程中不可或缺，其生产厂家较多、价格偏贵，实验室为节约成本可能会采购成本低的，加之瓶口较小，不易有效清洗，实验室因此发生的污染事件较多，您的实验室发生过此类事件吗？您在调查中都做了哪些？老王继之前的OOS事件剖析之“溶出度”之后，再给大家分享一个由液相小瓶引发的谜案，希望能给大家带来些许启示。
一、案例描述：
进行某口服固体制剂有关物质方法验证（精密度）时发现：6份100%的加标供试品（供试品+待测杂质）中杂质A的回收率相差较大，有的回收率低于80%，不符合验证要求（要求80%-120%），有的回收率符合要求，大约98%左右。
二、侦破过程：
调查1 ：仔细对比找规律
因对照品溶液与加标供试品溶液中加入的杂质A为同一份贮备液，做验证的人员也是岗位的操作能手，出现操作失误的可能较小，这样的情况挺异常的。仔细查看和对比色谱图发现：回收率不符合要求的加标供试品溶液色谱图中，杂质A峰面积比回收率符合要求的100%的加标供试品溶液、以及杂质A对照品溶液的峰面积明显偏低，同时多了一个未知峰（保留时间约15分钟），峰面积与色谱图见表1、图1、图2（仅引用一组数据和色谱图）。
表1
图1：对照品溶液色谱图（杂质A对照品+主成分对照品）
图2：加标供试品溶液色谱图（供试品溶液+杂质A对照品）
老王提示：一定要关注色谱图中的异常峰（仔细对比、有效识别），能够为异常调查提供方向。
由于对照品溶液中杂质A与加标供试品溶液中的杂质A使用同一份贮备液，同时又发现了未知峰（保留时间约15分钟），老套路，继续对比和分析所有的色谱图。当然，收获很大，又有了新发现：部分对照品溶液色谱图中也偶有该未知峰（保留时间约15分钟）出现，其他加标供试品溶液色谱图中该未知峰的大小不一，毫无规律。同时发现只要色谱图中出现了保留时间约为15分钟的未知峰，杂质A的峰面积就会减小，并且杂质A峰面积和未知峰面积相加后与杂质A对照品的峰面积接近，（如上图中，加标供试品溶液中杂质A峰面积68.42与未知峰峰面积24.92相加后等于93.34，与杂质A对照品的峰面积90.15接近）初步推断回收率偏低的原因可能是杂质A降解导致。
结合杂质A的性质，其在光照、高温条件下容易降解，验证人员回顾整个试验过程：该试验在严格的避光状态下进行，同时制备的溶液中有的杂质A正常，有的杂质A降低，所以排除避光不严格导致降解的可能；试验过程中也无高温因素，因此考虑是否为检验过程中的污染导致杂质A降解。
老王提示：发现异常的端倪，一定要扩大范围查找更多有价值的信息。
试验过程中使用的器具有容量瓶、移液管、一次性注射器、液相小瓶等，一次性注射液器是新的，验证人员反馈本次验证采用的液相小瓶也是新的。初步调查直接考虑清洗容量瓶和移液管用到的乙醇、铬酸洗液、洗衣粉进行相应的假设试验，结果令老王惊喜万分，你们可以猜猜这次老王的老花眼中有没有冒出金光？假设试验结果见表2。
在调查3中仅进了一针模拟乙醇残留的，杂质A峰面积减小，未知峰出现，是找见了原因还是偶然事件？
未确定真正原因，我们将对照品+乙醇的溶液在其他仪器上重复检验，同时又重新制备一份对照品+乙醇进行再次假设试验，均未出现保留时间约15分钟的未知峰。
结果不能重现？
为什么？
是否为加入乙醇的量不同一造成？
还是乙醇并不是“肇事者”？
不得而知……有小伙伴理解老王“一个脑壳两个大”的感受吗？
调查4：柳暗花明之后又现山重水复，再次推翻初步调查结果
老王提示：有时眼见未必为实，调查中不能仅以一次结果定结论（可能存在偶然性）
调查4中结果不能重现，怎么办？老王的风格之前已经曝光了，遇到问题喜欢追根究底。那么大家都应该猜到了吧，继续调查！是否为仪器和色谱柱导致？于是我们采用2台HPLC，用同一份溶液灌注在不同的新的液相小瓶中分别在2台不同的HPLC上同步检测，看是否可以重现初次调查结果？
调查5中，同样的溶液灌注在不同液相小瓶中，用不同的HPLC检测结果不同，是否为仪器和色谱柱导致？
于是再次更换了色谱柱和仪器，采用3号HPLC号仪器和色谱柱将1号HPLC、2号HPLC上的原液相小瓶中的溶液重新检验。
结果分别与1号HPLC、2号HPLC的初始杂质A、未知峰的峰面积等均一致（原本有的仍有，原本无的仍无），这样直接就排除了仪器和色谱柱的原因。
那么真正的“元凶”到底是谁呢？
调查6： 为什么同一份溶液在不同仪器上结果会不同呢？
“拍拍身上的灰尘，振作疲惫的精神，问题根源也许难查找，还是要追根究底彻底调查……”哼唱着改编的“壮志在我胸”继续调查（这首歌估计又把老王的年龄曝光了，知道这首歌的人芳龄都在40+吧）。之前的调查中排除了仪器、色谱柱、容量瓶清洗等原因，假设试验中采用对照品溶液进行，检验人员认为其较干净，所以在溶液制备完成到灌注液相小瓶时均未使用注射器和过滤头，直接将容量瓶内的溶液灌注到新的液相小瓶内。那么可以排除过滤的原因，可疑的环节只剩液相小瓶了。在初始调查和每次的假设试验中，检验人员均告知采用新的液相小瓶，所以未考虑其污染的可能性，经过调查和排除，可疑的环节只剩余液相小瓶了，现在该好好审审液相小瓶了！“把近期使用的液相小瓶、瓶盖和垫片给我押上来……”，看到检验人员拿来的液相小瓶，老王老花眼中的金光再次冒出来了，拿来的是棕色的液相小瓶，颜色较之前经常用的两个品牌的浅，棕色偏黄的感觉，用文字不好形容（品牌不能曝光，否则厂家可能会追杀老王吧），查看了该批次液相小瓶的接收和领用记录发现：出现异常峰所使用的液相小瓶为XXXX.07.10开始使用（做杂质A验证期间领用），颜色明显浅于之前未出现异常峰的液相小瓶。于是紧急从其他实验室借来其他两个常用品牌的液相小瓶再次进行了假设试验（品牌也不能曝光，怕大家以为老王是卖液相小瓶的）。
本次试验采用3个不同生产厂家的新液相小瓶进行（使用时不进行涮洗），分别为：老品牌的液相小瓶1、老品牌的液相小瓶2、XXXX.07.10新使用的液相小瓶，将同一份加标供试品溶液分别灌注在3种不同厂家的小瓶中（各灌注3份），假设试验结果见表4。
三、导致该偏差的根本原因：
老王提示：实验室调查犹如侦破悬案一样，调查人员犹如侦探+警察，除了需要具备深厚的理论知识，逻辑思维能力还要有丰富的经验以及汇总分析能力，以及打破沙锅问到底的精神，才能找出根本原因，制定纠正预防错误避免相同的事件重复发生；更少不了合理的假设试验来支持调查，分析人员也不用怕调查过程复杂，不用怕假设试验会增加自己工作量。做这些工作利于找出根本原因，也利于预防和避免后续发生相同的事件，减少无效重复工作。
2. 人员使用新购液相小瓶前未进行有效清洗（因客服或工程师告知检验人员，小瓶经过高温煅烧，新瓶使用前可不用清洗直接使用）
1. 封存该批次液相小瓶不再使用，与厂家沟通退货事宜
3. 文件中规定对于新液相小瓶使用前需要清洗或用待测溶液涮洗以及详细的清洗方法
1. 液相小瓶，瓶盖、垫片，使用新的不代表是绝对干净的（新的≠干净），使用前一定要进行清洗或涮洗（可以用干净溶剂或待测溶液涮洗3遍以上，可以是5遍、7遍甚至更多）
2. 关于液相小瓶的有效清洗：洗液相小瓶容易，但洗得很干净却很难。不是不认真洗，是因为方法不正确，因液相小瓶瓶口较小，溶液不容易进出。在清洗的任何一个环节中，都需要注意要将溶液/清洗剂灌进小瓶内，经过震荡或超声后还要将其用力甩出来，记得用力甩甩甩，最后还要烘干干！
3. 关于液相小瓶重复利用的问题：为防止污染和交叉污染，豪横的实验室都一次性使用；考虑到企业和实验室成本也可以有效清洗后重复利用，建议最好专产品专用。
4. 关于液相小瓶采购：液相小瓶价格较为昂贵，实验室为节约成本，可能会通过比价等采购成本较低的液相小瓶的行为，建议作出决定前考虑风险获益比，因为发生偏差或出现异常的调查成本其实更高，耗费人力、时间、检验耗材、仪器、对照品以及增加实验室管理成本。
OOS/偏差调查只有原则，无固定套路，要结合具体情况量身定制，并且随时都可能要作补充调查及相应的假设试验。老王再给大家分享一个“液相小瓶清洗之歌”
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